Les protéines purifiées sont rarement dans le tampon exact requis pour l’étape suivante — que ce soit la cristallisation, les dosages d’activité ou la formulation. La dialyse, l’ultrafiltration et les colonnes de dessalage sont les outils standard pour l’échange de tampon.
Dialyse
La dialyse utilise une membrane semi-perméable avec un seuil de coupure de poids moléculaire (MWCO) défini pour séparer les petites molécules des plus grandes. L’échantillon de protéine est scellé à l’intérieur du tube de dialyse et placé dans un grand volume du tampon désiré. Les petites molécules (sels, agents réducteurs, dénaturants) diffusent à travers la membrane dans le dialysat jusqu’à l’équilibre.
Choix du MWCO : choisissez une membrane avec une taille de pores inférieure à la moitié du poids moléculaire de la protéine pour garantir une rétention complète. Les valeurs MWCO standard sont 3,5, 6–8, 10 et 14 kDa. Pour la plupart des protéines, un MWCO de 6–8 kDa ou 10 kDa est approprié.
Protocole :
- Pré-humidifiez la membrane de dialyse dans de l’eau distillée ou du tampon pendant 30 minutes.
- Rincez avec le tampon de dialyse.
- Chargez l’échantillon dans le tube, en laissant un espace d’air pour les changements de volume.
- Scellez avec des pinces et placez dans 100–200 volumes de tampon.
- Agitez doucement à 4 °C. Changez le tampon 2–3 fois sur 12–24 heures.
- Récupérez l’échantillon — il peut s’être légèrement dilué en raison des effets osmotiques.
Les cassettes Slide-A-Lyzer (Thermo) utilisent un cadre en plastique rigide avec une membrane intégrée, éliminant le besoin de manipulation du tube. Elles flottent sur le tampon et sont plus faciles à manipuler pour les petits volumes.
Ultrafiltration (Concentrateurs Centrifuges)
Les concentrateurs centrifuges (Amicon Ultra, Vivaspin) combinent la filtration avec la centrifugation. Une membrane au fond d’un réservoir d’échantillon permet à l’eau et aux petits solutés de passer tout en retenant la protéine au-dessus de la membrane. La centrifugation à 3000–5000 × g force le liquide à travers la membrane.
Concentration : le volume de l’échantillon est réduit en éliminant le filtrat. Effectuez des centrifugations courtes (5–10 minutes) pour éviter la surconcentration, qui peut provoquer une précipitation. Surveillez le volume de rétentat à l’aide des marquages sur le dispositif.
Échange de tampon par diafiltration : au lieu de concentrer jusqu’à siccité, ajoutez le nouveau tampon au rétentat et centrifugez à nouveau. Répétez 3–5 fois ; chaque cycle échange environ 90 % du tampon. Cinq cycles atteignent >99,99 % d’échange.
Choix du MWCO : comme pour la dialyse, choisissez un MWCO au moins 2× plus petit que la protéine. Contrairement à la dialyse, le MWCO nominal des concentrateurs est basé sur la rétention des protéines globulaires — les polymères linéaires et certains détergents peuvent traverser une membrane nominalement rétentive.
Colonnes de Dessalage (Exclusion de Taille)
Les colonnes de dessalage (PD-10, Zeba Spin, NAP-5) utilisent la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec des colonnes de petites billes. L’échantillon est appliqué sur la colonne, et les grandes molécules (protéines) s’éluent dans le volume mort, avant les petites molécules (sels, nucléotides, agents réducteurs). La protéine est collectée dans le nouveau tampon sans dilution (PD-10) ou avec une dilution minimale (Zeba).
Le dessalage est plus rapide que la dialyse (5–15 minutes contre des heures) mais est limité aux volumes d’échantillon appropriés pour la taille de la colonne (généralement 0,5–2,5 mL). Pour les volumes plus importants, la dialyse ou la filtration tangentielle est utilisée.
