Quantifier précisément l’ADN et l’ARN est un prérequis pour une biologie moléculaire reproductible. Deux approches principales dominent : la spectrophotométrie et la fluorométrie.

Spectrophotométrie UV (NanoDrop)

Le spectrophotomètre NanoDrop mesure 1–2 µL d’échantillon déposé directement sur un piédestal, utilisant la tension superficielle pour créer une longueur de trajet définie (0,2–1,0 mm). Il mesure l’absorbance à 230, 260 et 280 nm :

• A₂₆₀ mesure la concentration en acides nucléiques. Pour l’ADNdb, 1 DO₂₆₀ = 50 ng/µL ; pour l’ARN, 1 DO₂₆₀ = 40 ng/µL ; pour l’ADNsb, 1 DO₂₆₀ = 33 ng/µL.
• A₂₈₀ mesure la contamination par les protéines et le phénol. Un échantillon d’ADN pur a un rapport A₂₆₀/A₂₈₀ d’environ 1,8 ; l’ARN pur environ 2,0.
• A₂₃₀ mesure les composés organiques, les sels chaotropiques et le phénol. Le rapport A₂₆₀/A₂₃₀ doit être d’environ 2,0–2,2 pour les acides nucléiques purs.

Le NanoDrop est rapide et nécessite un minimum d’échantillon mais ne peut pas distinguer l’ADN de l’ARN et est affecté par les nucléotides, les fragments simple brin et autres contaminants absorbant les UV.

Quantification Fluorométrique (Qubit)

Le fluoromètre Qubit utilise des colorants fluorescents qui se lient spécifiquement à l’ADNdb, à l’ARN ou aux protéines. Une fois lié, le colorant fluoresce fortement, et l’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration.

Les dosages Qubit sont hautement sélectifs — le dosage ADNdb ne détecte pas l’ADNsb ou l’ARN, et le dosage ARN ne détecte pas l’ADN. Ils sont également plus sensibles que la spectrophotométrie, détectant des concentrations aussi faibles que 0,1 ng/µL. Le compromis est le coût par dosage (les réactifs sont à base de colorants) et la nécessité de deux étalons de calibration par dosage.

Choix d’une Méthode

Utilisez la spectrophotométrie pour la quantification de routine de l’ADN plasmidique purifié, des produits de PCR sans contamination protéique et la vérification des rapports de pureté. Utilisez la fluorométrie pour les échantillons précieux (préparation de bibliothèques NGS, ADN ChIP), lorsque l’échantillon contient des nucléotides ou des fragments dégradés, ou lorsque vous devez quantifier spécifiquement l’ADNdb en présence d’ARN.

Quantification sur Gel d’Agarose

Pour une évaluation semi-quantitative, faites migrer l’échantillon sur un gel d’agarose avec un marqueur de poids moléculaire ayant des intensités de bande connues (par exemple, 100 ng, 50 ng, 25 ng). L’intensité de fluorescence du bromure d’éthidium ou du SYBR Safe est grossièrement corrélée à la masse. Les systèmes d’imagerie de gel numériques peuvent intégrer l’intensité des bandes pour une estimation, mais cette méthode est moins précise que la spectrophotométrie ou la fluorométrie.