L’hybridation in situ en fluorescence utilise des sondes d’ADN marquées par fluorescence pour détecter et localiser des séquences d’ADN spécifiques sur les chromosomes métaphasiques et dans les noyaux interphasiques, permettant la visualisation directe de l’organisation génomique et des anomalies.
Principe
Le FISH suit les mêmes principes d’hybridation que l’hybridation in situ colorimétrique mais utilise des sondes conjuguées à des fluorophores pour une détection directe sans amplification enzymatique. Les signaux fluorescents sont visualisés par microscopie à épifluorescence ou confocale. Plusieurs sondes avec des fluorophores distincts peuvent être appliquées simultanément, permettant une analyse multicolore de plusieurs loci génomiques dans un même spécimen.
Types de Sondes
Les sondes spécifiques de locus ciblent des régions génomiques uniques, typiquement 50–500 kb clonées dans des BAC ou des fosmides. Elles sont marquées par nick translation avec des nucléotides fluorescents tels que SpectrumOrange, SpectrumGreen ou Cy5. Les sondes centromériques ciblent les séquences répétées d’alpha-satellite et identifient des chromosomes spécifiques. Les sondes télomériques marquent les extrémités des chromosomes. Les sondes de peinture chromosomique sont des mélanges complexes de séquences uniques à un seul chromosome, générées par tri cytométrique ou microdissection. Les jeux de sondes à base d’oligonucléotides synthétisés sur microréseaux offrent désormais une couverture personnalisable à haute résolution.
Méthodes de Marquage
Le marquage direct incorpore des nucléotides conjugués à des fluorophores lors de la synthèse de la sonde. La détection est immédiate après hybridation. Le marquage indirect incorpore des haptènes tels que la digoxigénine ou la biotine, qui sont détectés après hybridation avec des anticorps conjugués à des fluorophores ou de la streptavidine. Les méthodes indirectes fournissent une amplification du signal par l’intermédiaire de couches d’anticorps et sont utiles pour les petites cibles. L’amplification du signal par tyramide augmente encore la sensibilité.
Préparation des Échantillons
Les étalements de chromosomes métaphasiques sont préparés à partir de cultures cellulaires arrêtées par la colcémide, gonflées hypotoniquement et fixées dans du méthanol:acide acétique (3:1). Les noyaux interphasiques sont obtenus à partir de cellules non cultivées ou de tissus fixés. Les spécimens sont vieillis, traités à la RNase et à la pepsine pour réduire le bruit de fond, et déshydratés par une série d’éthanol. La dénaturation de l’ADN cible dans du formamide à 70 % à 72 °C est nécessaire pour les sondes double brin. Des protocoles sans formamide utilisant la dénaturation thermique dans le tampon d’hybridation sont des alternatives.
Hybridation et Lavage
La sonde et la cible sont co-dénaturées à 75 °C pendant 5 minutes, puis hybridées à 37 °C pendant 4–16 heures dans une chambre humidifiée. Les lavages post-hybridation dans du SSC et du Tween-20 éliminent la sonde non liée. La stringence est contrôlée par la concentration de formamide, la température de lavage et la concentration saline. Après les lavages, les lames sont contre-colorées au DAPI, qui produit un motif de bandes Q sur les chromosomes métaphasiques pour l’identification caryotypique.
FISH Multicolore
Le FISH multiplex (M-FISH) utilise des combinaisons de cinq fluorophores dans un schéma de marquage combinatoire pour générer 24 jeux de sondes spécifiques de chaque chromosome, chacun avec une signature spectrale unique. Le caryotypage spectral utilise une approche similaire avec imagerie spectrométrique. Ces techniques permettent une analyse caryotypique complète en une seule expérience, détectant les réarrangements complexes, les chromosomes marqueurs et les translocations cryptiques.
Applications
Le FISH est un pilier clinique pour la détection des aneuploïdies chromosomiques dans le diagnostic prénatal utilisant des amniocytes non cultivés et des échantillons de villosités choriales. Le statut d’amplification du gène HER2 dans le cancer du sein est évalué de routine par FISH. La détection de la fusion BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chronique utilise des sondes bicolores à double fusion sur noyaux interphasiques. Le chromosome Philadelphie t(9;22) apparaît comme un signal de fusion. Le FISH sur coupes tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine cartographie les altérations génomiques dans les tumeurs solides. Les peintures chromosomiques spécifiques sont essentielles en radiobiologie pour quantifier les dommages et la réparation de l’ADN par les tests de micronoyaux et de translocations.
