Clonage Gateway

Le clonage Gateway utilise le système de recombinaison site-spécifique du bactériophage lambda. Il élimine le besoin d’enzymes de restriction et d’ADN ligase en utilisant des séquences de recombinaison reconnues par des enzymes spécifiques.

Le système fonctionne en deux réactions :

• Réaction BP : un produit de PCR flanqué de sites attB se recombine avec un vecteur donneur (pDONR) contenant des sites attP. Le mélange d’enzymes BP clonase catalysé la réaction, produisant un clone d’entrée avec l’insert flanqué de sites attL.
• Réaction LR : le clone d’entrée se recombine avec un vecteur de destination contenant des sites attR. La LR clonase transfère l’insert dans le vecteur de destination, qui fournit les éléments d’expression appropriés (promoteur, étiquette, marqueur de sélection) pour l’organisme cible.

Le clonage Gateway est directionnel, préserve le cadre de lecture et permet de transférer le même clone d’entrée dans des dizaines de vecteurs de destination (par exemple, pour l’expression chez les bactéries, les cellules de mammifères, les levures ou les plantes). La principale limitation est la taille des sites de recombinaison (attB1 et attB2 font ~50 pb chacun), qui ajoutent des acides aminés supplémentaires à la protéine exprimée à moins d’être éliminés par une étape de clivage par protéase.

Clonage TOPO

Le clonage TOPO utilise la topoisomérase I du virus Vaccinia, qui coupe l’ADN et reste liée de manière covalente au phosphate 3’. Un vecteur TOPO linéarisé a la topoisomérase attachée aux deux extrémités. Lorsqu’un produit de PCR avec des extrémités compatibles est ajouté, la topoisomérase relige le vecteur, insérant le produit de PCR — aucune ligase n’est nécessaire.

Clonage TOPO TA : La Taq polymérase ajoute une seule extension 3’-A aux produits de PCR. Le vecteur TOPO a des extensions 3’-T complémentaires. Le produit de PCR est mélangé avec le vecteur linéarisé à température ambiante pendant 5 minutes, puis transformé dans des cellules compétentes. C’est la méthode de clonage la plus simple disponible, sans digestion par restriction, ligation ou purification post-PCR.

Clonage TOPO à bouts francs : Les produits de PCR avec des extrémités franches (provenant de polymérases avec activité correctrice) sont clonés en utilisant une version du vecteur TOPO optimisée pour la ligation à bouts francs. L’efficacité est comparable au clonage TA avec le vecteur approprié.

Choix Entre les Deux

Le clonage TOPO est plus rapide (5 minutes à température ambiante) et mieux adapté pour le sous-clonage rapide d’un seul insert. Gateway nécessite plus de préparation (adaptateurs attB sur les amorces PCR, vecteurs d’entrée et de destination séparés) mais passe à l’échelle pour les applications à haut débit et rend le changement entre systèmes d’expression trivial.