Alors que les constructions de biologie synthétique gagnent en complexité, le clonage par restriction traditionnel devient peu pratique. L’assemblage Gibson et le clonage Golden Gate permettent l’assemblage multi-fragments en une seule réaction dans un seul tube.

Assemblage Gibson

L’assemblage Gibson joint plusieurs fragments d’ADN avec des extrémités chevauchantes en une seule réaction isotherme à 50 °C. Le mélange réactionnel contient trois activités enzymatiques :

• 5’ exonucléase (T5 exonucléase ou RecE) : dégrade les extrémités 5’ de l’ADN double brin, laissant des extrémités 3’ simple brin qui permettent l’hybridation de fragments complémentaires.
• ADN polymérase (Phusion ou Taq) : comble les lacunes laissées après l’hybridation.
• ADN ligase (Taq ligase) : scelle les coupures dans l’ADN assemblé.

Chaque fragment doit avoir 15–40 pb d’homologie avec son voisin à la jonction. Ces chevauchements sont ajoutés par des amorces PCR. L’assemblage Gibson peut joindre 2–15 fragments simultanément. Le montage est sans cicatrice — aucun site de restriction ne reste dans le produit final.

La réaction nécessite 50–100 ng de chaque fragment en quantités équimolaires et est terminée en 15–60 minutes à 50 °C. Le produit est transformé directement dans E. coli chimio-compétente. L’assemblage Gibson est idéal pour :

• Assembler des gènes synthétiques à partir d’oligonucléotides.
• Construire des plasmides entiers à partir de fragments chevauchants.
• Construire des cassettes d’ingénierie génomique avec des bras d’homologie.
• Créer des banques d’ADN pour l’évolution dirigée.

Clonage Golden Gate

Le clonage Golden Gate utilise des enzymes de restriction de type IIS (BsaI, BpiI, Esp3I) qui coupent en dehors de leur séquence de reconnaissance, produisant des extrémités simple brin définies de 4 pb. Ces extrémités peuvent être spécifiées par l’utilisateur.

La réaction est une digestion-ligation simultanée : l’enzyme de type IIS et l’ADN ligase T4 sont ajoutés ensemble dans un seul tube, et le mélange réactionnel est cyclé entre la température optimale de l’enzyme (37 °C pour BsaI) et 16 °C ou 37 °C (pour la ligation). Comme les sites de reconnaissance sont éliminés du produit assemblé final, la réaction est menée à son terme — le produit assemblé ne peut pas être redigéré.

Golden Gate est à la base des standards de clonage modulaire comme MoClo, Golden Braid et Plant Toolbox. Il est idéal pour :

• L’assemblage combinatoire de parties génétiques (promoteurs, UTR 5’, CDS, terminateurs, étiquettes).
• La construction de tableaux TALEN à partir de modules répétés individuels.
• La construction de banques de sgRNA poolées pour les cribles CRISPR.

Les extrémités sont conçues pour être mutuellement compatibles dans un ordre défini, permettant au même vecteur d’accepter différentes combinaisons de parties. Golden Gate est plus évolutif que l’assemblage Gibson pour les projets combinatoires modulaires, bien qu’il nécessite que les fragments n’aient pas de sites de reconnaissance internes pour l’enzyme utilisée.