La chromatographie d’interaction hydrophobe sépare les protéines en fonction des différences d’hydrophobicité de surface. Les protéines sont chargées dans des conditions de haute salinité qui favorisent les interactions hydrophobes avec la phase stationnaire et éluées en diminuant la concentration en sel, ce qui affaiblit l’effet hydrophobe.
Principe
À des concentrations élevées de sel, les molécules d’eau sont ordonnées autour des ions salins (effet de relargage), réduisant la disponibilité de l’eau pour solvater les zones hydrophobes à la surface des protéines. Cela force les régions hydrophobes des protéines à interagir avec les ligands hydrophobes immobilisés sur le milieu chromatographique. Lorsque la concentration en sel est réduite pendant l’élution, l’eau devient plus disponible, les interactions hydrophobes s’affaiblissent et les protéines s’éluent dans l’ordre croissant de leur hydrophobicité de surface. La liaison dépend du type et de la concentration du sel, le sulfate d’ammonium, le sulfate de sodium et le NaCl étant des choix courants classés dans la série de Hofmeister selon leur force de relargage.
Sélectivité et Résolution
La sélectivité de la HIC est orthogonale à la chromatographie par échange d’ions et à la chromatographie par exclusion de taille. La résolution dépend du type de ligand (alkyle — butyle, octyle, phényle), de la densité du ligand, de la pente du gradient de sel et de la température. Les gradients linéaires de 10–20 volumes de colonne fournissent typiquement la meilleure résolution. L’élution par paliers est utilisée pour la capture à l’échelle du procédé. Les ligands phényle offrent à la fois des interactions hydrophobes et aromatiques, fournissant une sélectivité distincte des ligands alkyle à chaîne droite.
Milieux de Colonne
Les résines HIC courantes comprennent le butyl- et l’octyl-Sepharose (GE Healthcare), le Phényle et le Butyle Toyopearl (Tosoh), et les supports Macro-Prep t-Butyle et Méthyle HIC (Bio-Rad). Les résines varient en hydrophobicité : butyle > octyle pour les chaînes alkyles à densité équivalente. Les tailles de particules de 30–100 µm équilibrent la résolution et les propriétés d’écoulement pour le travail préparatif.
Considérations sur les Tampons
Les tampons de chargement contiennent 1–2 M de sulfate d’ammonium ou 3–4 M de NaCl. L’élution utilise le même tampon sans sel. L’abaissement du pH ou l’inclusion d’éthylène glycol réduit encore les interactions hydrophobes pour les protéines fortement liées. Les détergents doivent être évités car ils interfèrent avec la liaison hydrophobe. Les échantillons sont souvent ajustés directement en ajoutant du sel solide ou en diluant avec des solutions concentrées de sel.
Développement de Méthode
Commencer par une petite colonne de criblage (1 mL) testant deux ou trois chimies de résine à deux concentrations de sel. Charger 5–10 mg de protéine par mL de résine. Laver avec 5 volumes de colonne de tampon de chargement. Éluer avec un gradient linéaire de 10 volumes de colonne jusqu’à zéro sel. Collecter des fractions de 1 mL et analyser par SDS-PAGE. Optimiser la pente du gradient pour la séparation cible.
Applications
La HIC est largement utilisée dans la fabrication biopharmaceutique comme étape de purification intermédiaire ou de polissage. Elle élimine efficacement les agrégats, les isoformes clivées et les protéines de la cellule hôte après une étape de capture telle que la Protéine A ou IMAC. La HIC est particulièrement efficace pour éliminer les contaminants hydrophobes incluant les endotoxines, les protéines liées à l’ADN et les particules virales. Elle est couramment couplée aux systèmes FPLC pour l’exécution automatisée de méthodes.
