L’immunofluorescence (IF) et l’immunocytochimie (ICC) sont des techniques basées sur les anticorps qui révèlent où une protéine est localisée dans une cellule au niveau subcellulaire. L’IF utilise des colorants fluorescents ; l’ICC utilise des enzymes chromogènes. Les deux sont essentielles pour la biologie cellulaire, la pathologie et la découverte de médicaments.

Méthodes Directe vs. Indirecte

IF directe : un anticorps primaire est directement conjugué à un fluorophore. Rapide (une seule incubation) et faible bruit de fond, mais l’amplification du signal est limitée car un seul anticorps se lie par antigène.

IF indirecte : un anticorps primaire non conjugué se lie à la cible, et un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore se lie au primaire. L’amplification du signal se produit car plusieurs anticorps secondaires se lient à chaque anticorps primaire. C’est l’approche la plus courante, car elle fonctionne avec de nombreux anticorps primaires de la même espèce hôte.

Préparation des Échantillons

1. Fixation : préserve la structure cellulaire et immobilise les antigènes. Le paraformaldéhyde (PFA 4 %, 15 minutes à température ambiante) est le fixateur le plus courant pour l’IF. Il réticule les protéines via les groupes aminés. La fixation au méthanol/acétone est plus rapide mais peut déformer la morphologie et détruire certains épitopes.
2. Perméabilisation : permet aux anticorps d’accéder aux antigènes intracellulaires. Triton X-100 (0,1–0,5 %) ou saponine (0,1 %, plus douce) pendant 10–15 minutes. Sautez la perméabilisation si vous colorez uniquement les antigènes de surface.
3. Blocage : incubez avec de la BSA à 1–5 %, du sérum normal à 5–10 % (de l’espèce hôte de l’anticorps secondaire) ou un tampon de blocage commercial pendant 30–60 minutes pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps.
4. Anticorps primaire : incubez dans du tampon de blocage à 4 °C toute la nuit ou à température ambiante pendant 1–2 heures. Optimisez la dilution empiriquement.
5. Lavage : 3 × 5 minutes dans du PBS.
6. Anticorps secondaire : incubez pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité (les fluorophores sont sensibles à la lumière).
7. Lavage : 3 × 5 minutes dans du PBS.
8. Contre-coloration et montage : DAPI ou Hoechst 33342 pour colorer les noyaux (5 minutes). Montez avec un milieu de montage anti-photoblanchiment.

Contrôles

• Contrôle sans anticorps primaire : anticorps secondaire seulement — ne doit montrer aucune coloration spécifique.
• Contrôle isotypique : anticorps primaire remplacé par un anticorps non spécifique du même isotype.
• Contrôle du peptide de blocage : pré-incubez l’anticorps primaire avec le peptide immunisant pour abolir la coloration spécifique.
• Contrôle knock-out : les cellules dépourvues de la protéine cible confirment la spécificité de l’anticorps.

Multiplexage

Plusieurs protéines peuvent être imagées simultanément en utilisant des anticorps primaires produits dans différentes espèces hôtes (souris, lapin, chèvre, rat) avec des anticorps secondaires spécifiques à chaque espèce conjugués à des fluorophores distincts (DAPI (bleu), Alexa 488 (vert), Alexa 568 (rouge), Alexa 647 (rouge lointain)). Le démélange spectral ou les filtres à bande étroite empêchent le chevauchement entre les canaux.

Acquisition d’Images

Utilisez un microscope à fluorescence à champ large pour les échantillons ou couches minces, un microscope confocal pour les échantillons plus épais (la section optique élimine le flou hors foyer), et un microscope à illumination structurée ou STED pour l’imagerie super-résolution en dessous de la limite de diffraction. Réglez les temps d’exposition par rapport au contrôle sans primaire pour garantir que le signal spécifique est au-dessus du bruit de fond.