La chromatographie électrocinétique micellaire (MEKC) est un mode d’électrophorèse capillaire (CE) introduit par Shigeru Terabe en 1984 qui étend les capacités de séparation de la CE aux analystes neutres. En MEKC, les molécules de tensioactif ajoutées au tampon de migration à des concentrations supérieures à la concentration micellaire critique (CMC) s’auto-assemblent en micelles qui agissent comme une phase pseudostationnaire. La séparation des analystes résulte du partage différentiel des solutés entre le tampon aqueux (phase mobile) et l’intérieur hydrophobe des micelles (phase pseudostationnaire), combiné à la migration différentielle des micelles chargées sous le champ électrique appliqué. La MEKC fait le pont entre l’électrophorèse classique, qui nécessite des analystes chargés, et la chromatographie, qui repose sur le partage différentiel entre phases.
Le principe de solubilisation et de partage micellaire
Les tensioactifs sont des molécules amphiphiles contenant à la fois une tête hydrophile et une queue hydrophobe. En solution aqueuse à des concentrations supérieures à la CMC, les monomères de tensioactif s’agrègent pour former des micelles avec les queues hydrophobes orientées vers l’intérieur et les têtes hydrophiles face au tampon aqueux. Pour le dodécylsulfate de sodium (SDS), le tensioactif le plus courant en MEKC, la CMC est d’environ 8 mM dans l’eau, et chaque micelle contient environ 60 à 70 monomères. Les analystes neutres se répartissent entre la phase aqueuse et la pseudophase micellaire en fonction de leur hydrophobicité : les solutés hydrophobes sont plus fortement retenus par les micelles et migrent à la même vitesse que celles-ci, tandis que les solutés hydrophiles passent plus de temps dans la phase aqueuse et migrent avec le flux électroosmotique global. Les analystes chargés subissent une composante de mobilité électrophorétique supplémentaire qui influence leur comportement de migration global.
La phase pseudostationnaire
La phase pseudostationnaire en MEKC n’est pas fixée physiquement mais se déplace à une vitesse déterminée par la mobilité électrophorétique des micelles et le flux électroosmotique (EOF). Les tensioactifs anioniques comme le SDS migrent vers l’anode, mais dans des conditions CE typiques, l’EOF vers la cathode est plus fort, ce qui fait que les micelles migrent dans la même direction que le flux global mais à une vitesse réduite. Cela crée une fenêtre de migration entre l’analyte le plus rapide (qui n’interagit pas avec les micelles et migre avec l’EOF) et l’analyte le plus lent (qui est complètement retenu par les micelles). Tous les analystes neutres s’éluent dans cette fenêtre, appelée gamme d’élution. La largeur de la gamme d’élution est déterminée par le rapport du temps de migration des micelles à celui de l’EOF et est un paramètre critique affectant la résolution. D’autres tensioactifs que le SDS, notamment les tensioactifs cationiques comme le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), les tensioactifs non ioniques comme le Brij-35 et les sels biliaires comme le cholate de sodium, peuvent être utilisés pour modifier la sélectivité dans des applications spécifiques.
Résolution et efficacité en MEKC
La résolution en MEKC est régie par trois facteurs : l’efficacité de séparation (nombre de plateaux), la sélectivité (la différence relative des facteurs de rétention entre deux analystes) et la largeur de la gamme d’élution. Le nombre de plateaux en MEKC est similaire à celui de la CZE, généralement compris entre 100 000 et 300 000 plateaux par mètre, car le profil d’écoulement en bouchon de l’EOF minimise l’élargissement des bandes. La sélectivité est manipulée en changeant le type et la concentration du tensioactif, en ajoutant des modificateurs organiques comme le méthanol ou l’acétonitrile au tampon, ou en incorporant des cyclodextrines, de l’urée ou des réactifs de formation de paires d’ions dans le milieu de séparation. La gamme d’élution est élargie lorsque la vitesse de migration micellaire diffère significativement de la vitesse de l’EOF, ce qui peut être obtenu en ajustant le pH du tampon, la force ionique ou la chimie de la paroi capillaire. L’optimisation de la résolution en MEKC implique d’équilibrer ces paramètres pour obtenir une séparation adéquate de tous les analystes cibles dans un temps d’analyse raisonnable.
Paramètres opérationnels et développement de méthodes
Le choix du type et de la concentration de tensioactif est la variable principale dans le développement de méthodes MEKC. Le SDS à des concentrations de 20 à 100 mM est le point de départ par défaut en raison de son faible coût, de sa faible absorbance UV et de son comportement bien caractérisé. Le pH du tampon contrôle à la fois l’EOF et l’état d’ionisation des analystes acides ou basiques, la plage de pH 7 à 9 étant la plus courante pour les séparations à base de SDS. Des solvants organiques tels que le méthanol, l’acétonitrile et le 2-propanol sont ajoutés à 5-30 % pour réduire la rétention des analystes hautement hydrophobes et modifier la sélectivité. Le contrôle de la température est essentiel car la CMC, la taille des micelles et la viscosité du tampon varient toutes avec la température. La tension est généralement réglée entre 15 et 30 kV, les tensions plus élevées offrant des séparations plus rapides mais un échauffement par effet Joule accru. L’injection d’échantillon est effectuée par voie hydrodynamique pour éviter le biais introduit par l’injection électrocinétique en présence de micelles.
Applications de la MEKC
La MEKC est largement appliquée dans l’analyse pharmaceutique pour la détermination de la pureté, de l’uniformité de contenu et de la stabilité des médicaments, en particulier pour les médicaments neutres ou faiblement ionisés difficiles à séparer par CZE. Dans l’industrie agroalimentaire, la MEKC est utilisée pour analyser les conservateurs, les antioxydants, les édulcorants et la caféine dans des matrices complexes. Les applications environnementales comprennent la détermination des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), des pesticides et des phénols dans des échantillons d’eau et de sol. Dans l’analyse clinique et biomédicale, la MEKC a été employée pour la quantification des stéroïdes, des acides biliaires, des porphyrines et des vitamines dans les fluides biologiques. La technique est également utilisée dans l’analyse des produits naturels, notamment les flavonoïdes, les alcaloïdes et les coumarines dans les extraits de plantes. La combinaison de la MEKC avec la détection par spectrométrie de masse (MEKC-MS) par ionisation par électrospray étend son applicabilité à l’identification et à la caractérisation structurale de composés inconnus, nécessitant l’utilisation de tensioactifs volatils et de tampons compatibles avec la MS.
