Le clonage traditionnel par enzyme de restriction a été complété — et dans de nombreux laboratoires remplacé — par des méthodes recombinatoires et d’assemblage modulaire qui sont plus rapides, sans cicatrice et compatibles avec les workflows à haut débit.

Clonage Gateway

Le clonage Gateway utilise le système de recombinaison site-spécifique du bactériophage lambda. Deux réactions de recombinaison séquentielles déplacent une séquence d’ADN d’intérêt entre des vecteurs sans enzymes de restriction ni ligase.

Dans la réaction BP, un produit PCR flanqué de sites attB se recombine avec un vecteur donneur contenant des sites attP, créant un clone d’entrée. La réaction LR transfère ensuite l’insert du clone d’entrée dans n’importe quel vecteur de destination contenant des sites attR. Le vecteur de destination fournit les éléments d’expression appropriés pour l’organisme cible.

Le clonage Gateway est directionnel, ne modifie pas le cadre de lecture et permet au même clone d’entrée d’être transféré dans de multiples vecteurs de destination (par exemple, pour l’expression dans des bactéries, des cellules de mammifères ou des plantes). Sa principale limitation est la taille des sites de recombinaison (environ 50 pb chacun), qui ajoutent une séquence supplémentaire à la construction finale.

Assemblage Gibson

L’assemblage Gibson assemble plusieurs fragments d’ADN en une seule réaction isotherme (50 °C, 15–60 minutes). Il nécessite trois activités enzymatiques :

• Une exonucléase 5′ résèque les extrémités 5′, laissant des surplombs simple brin 3′ chevauchants.
• Une ADN polymérase comble les lacunes.
• Une ADN ligase scelle les coupures.

Les fragments doivent avoir 15–40 pb de séquence chevauchante à leurs extrémités, ce qui est généralement ajouté via des amorces PCR. L’assemblage Gibson peut assembler jusqu’à 10–15 fragments simultanément et est idéal pour assembler de grandes constructions telles que des gènes synthétiques, des plasmides entiers ou des cassettes de génie génomique. L’assemblage est sans cicatrice — aucun site de restriction n’est laissé derrière.

Clonage Golden Gate

Le clonage Golden Gate utilise des enzymes de restriction de type IIS, qui coupent en dehors de leur séquence de reconnaissance, produisant des surplombs définis de 4 pb. Ces surplombs peuvent être spécifiés par l’utilisateur et conçus pour être uniques et compatibles.

La réaction est une digestion-ligation en un seul pot : l’enzyme de type IIS et l’ADN ligase T4 sont ajoutés ensemble, et la réaction est cyclée entre la température optimale de l’enzyme et 37 °C. Parce que les sites de reconnaissance sont éliminés après la coupure, le produit assemblé final n’est plus digestible, ce qui conduit la réaction à son terme.

Golden Gate est la base des systèmes de clonage modulaire tels que MoClo et la Plant Toolbox. Il est idéal pour l’assemblage combinatoire de parties génétiques (promoteurs, séquences codantes, terminateurs) et pour la construction de banques de TALEN ou d’ARNsg.