PAGE Natif

Contrairement au SDS-PAGE, le PAGE natif (non dénaturant) sépare les protéines dans leur conformation native sans SDS ni agents réducteurs. La vitesse de migration dépend à la fois de la taille de la protéine et de sa charge intrinsèque, ce qui rend l’estimation du poids moléculaire moins simple qu’en SDS-PAGE — mais préserve l’activité enzymatique et les interactions protéine–protéine.

Tampons : Le système le plus courant est le système de tampon Laemmli sans SDS. Le gel de séparation est à pH 8,8 et le gel de concentration à pH 6,8, tous deux avec un tampon de migration Tris-glycine. Les protéines portent une charge nette négative au pH de migration et migrent vers l’anode.

Blue Native PAGE (BN-PAGE) : du Bleu de Coomassie G-250 est ajouté au tampon cathodique et à l’échantillon protéique. Le colorant se lie aux surfaces hydrophobes, conférant une charge négative uniforme sans dénaturer les protéines. Cela permet la séparation de complexes protéiques membranaires (par exemple, les supercomplexes de la chaîne respiratoire) qui sont insolubles dans des conditions natives standard.

Applications :

• Détermination de l’état oligomérique des protéines (monomère, dimère, tétramère).
• Analyse de complexes multiprotéiques par Western blot ou spectrométrie de masse après digestion dans le gel (PAGE natif suivi de SDS-PAGE 2D).
• Détection d’isoformes enzymatiques avec différentes mobilités électrophorétiques.
• Contrôle qualité pour la purification de protéines (évaluation de l’agrégation).

Limitations : la résolution est généralement inférieure à celle du SDS-PAGE. Les protéines acides et basiques co-migrent mal dans le même système de gel. L’étalonnage avec des marqueurs de poids moléculaire natifs ne donne que des tailles approximatives.

Zymographie

La zymographie détecte l’activité enzymatique directement dans un gel de polyacrylamide en copolymérisant un substrat dans le gel de séparation. Après électrophorèse, le gel est incubé dans un tampon de renaturation pour restaurer l’activité enzymatique, puis coloré. L’activité enzymatique apparaît comme une bande claire sur un fond sombre là où le substrat a été dégradé.

Types de zymographie :

• Zymographie à la gélatine : la gélatine (collagène dénaturé) est incorporée à 0,1 %. Utilisée pour les métalloprotéinases matricielles (MMP). Après incubation, le gel est coloré au Bleu de Coomassie — l’activité MMP apparaît comme des bandes blanches/transparentes sur un fond bleu.
• Zymographie à la caséine : la caséine est le substrat. Utilisée pour les sérines protéases et les activateurs du plasminogène.
• Zymographie inverse : le gel contient à la fois le substrat et un inhibiteur. L’activité inhibitrice apparaît comme des bandes sombres où le substrat est préservé de la dégradation.
• Dosages kinase dans le gel : le gel est polymérisé avec un substrat de protéine kinase, et après électrophorèse, renaturation et incubation avec [γ-³²P]ATP, les bandes phosphorylées sont détectées par autoradiographie.

Résumé du protocole pour la zymographie à la gélatine :

1. Préparez le gel de séparation avec 0,1 % de gélatine (et SDS).
2. Chargez les échantillons dans des conditions non réductrices (pas d’ébullition, pas d’agents réducteurs — ils dénaturent les MMP).
3. Migrez à 4 °C pour éviter une protéolyse prématurée.
4. Éliminez le SDS en lavant le gel dans du Triton X-100 à 2,5 % pendant 30 minutes (2 fois).
5. Incubez dans le tampon de développement (Tris 50 mM, CaCl₂ 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5) à 37 °C pendant 16–48 heures.
6. Colorez au Bleu de Coomassie et décolorez.

La zymographie est très sensible (détection de quantités picogrammaires d’enzyme active) et peut distinguer les formes pro-enzyme (latente) et active en fonction du poids moléculaire.