Les protéines A et G sont des protéines bactériennes de liaison aux immunoglobulines qui se lient à la région Fc des anticorps, permettant une purification rapide en une étape des anticorps polyclonaux et monoclonaux à partir de sérum, de liquide d’ascite ou de surnageants de culture cellulaire.
Principe
La protéine A (de Staphylococcus aureus) et la protéine G (de Streptococcus sp.) se lient spécifiquement à la région Fc des anticorps IgG sans reconnaître la région Fab de liaison à l’antigène. Cela préserve la fonctionnalité des anticorps après purification. Les protéines bactériennes sont immobilisées sur agarose ou billes magnétiques et utilisées comme réactifs de capture par affinité. Les anticorps se lient à pH physiologique et sont élués à pH bas (2,5–3,0), ce qui perturbe l’interaction Fc-Protéine A/G. Les fractions éluées sont immédiatement neutralisées pour empêcher la dénaturation acide.
Protéine A vs. Protéine G
La protéine A se lie aux sous-classes d’IgG humaines avec une affinité variable : forte pour IgG1, IgG2 et IgG4 mais faible pour IgG3. Elle se lie également bien aux IgG de lapin, porc, chien et cobaye mais mal aux IgG de chèvre, mouton, rat et souris IgG1. La protéine G se lie à une gamme plus large de sous-classes d’IgG à travers les espèces, y compris toutes les sous-classes d’IgG humaines, la souris IgG1, la chèvre, le mouton et le rat IgG. La protéine A/G est une protéine de fusion recombinante combinant les domaines de liaison des deux, offrant la couverture la plus large en espèces et sous-classes. Le choix dépend de l’espèce et de l’isotype de l’anticorps. Pour la plupart des sérums polyclonaux, l’agarose Protéine A/G offre le meilleur rendement.
Formats de Résine
Les protéines A, G et A/G sont disponibles couplées à l’agarose, au Sepharose et aux billes magnétiques. Le Sepharose Protéine A (Cytiva) et MabSelect SuRe (un dérivé de Protéine A stabilisé aux alcalis) sont des standards pour la purification d’anticorps monoclonaux. Les variants recombinants de la Protéine A avec une stabilité alcaline améliorée permettent le nettoyage avec 0,1–0,5 M NaOH pour l’élimination des endotoxines. La capacité de liaison varie de 5–20 mg d’IgG humaines par mL de résine, selon la résine et les conditions de débit. Les résines à haute capacité (30–50 mg/mL) sont utilisées pour le biotraitement.
Système de Tampons
Tampon de chargement : 20 mM phosphate de sodium, 150 mM NaCl, pH 7,4 (PBS) ou 20 mM Tris-HCl, pH 7,5–8,0. Tampon de lavage : identique au chargement, parfois avec 0,1 % Tween-20 ou 1 M NaCl pour un lavage stringeant. Tampon d’élution : 0,1 M glycine-HCl, pH 2,5–3,0, ou 0,1 M citrate, pH 3,0. Tampon de neutralisation : 1 M Tris-HCl, pH 8,5–9,0 (ajouter 50–100 µL par mL d’éluat). Pour une élution douce, 2–3 M MgCl₂ ou 3,5 M KSCN peuvent être utilisés, bien que ces chaotropes puissent affecter certains anticorps.
Protocole
Équilibrer la résine Protéine A/G avec le tampon de chargement. Charger le sérum clarifié (dilué 1:1 dans le tampon de chargement) ou le surnageant de culture (concentré 10 fois si faible titre) à 0,5–1 mL/min ou en rotation batch pendant 30 min à 4 °C. Laver avec 10–15 volumes de colonne de tampon de chargement jusqu’à ce que l’A₂₈₀ atteigne la ligne de base. Éluer avec 5–10 volumes de colonne de tampon d’élution, en collectant des fractions de 0,5–1 mL dans des tubes contenant du tampon de neutralisation. Regrouper les fractions du pic A₂₈₀ et dialyser ou échanger le tampon contre du PBS ou un tampon de stockage. La SDS-PAGE en conditions réductrices montre des bandes à 25 kDa (chaîne légère) et 50 kDa (chaîne lourde).
Maturation d’Affinité et Variants Modifiés
Les variants recombinants de la Protéine A (MabSelect SuRe, ProSep Ultra Plus) sont conçus pour une capacité de liaison plus élevée, une stabilité alcaline améliorée (>0,5 M NaOH pour le nettoyage en place) et une réduction de la lixiviation du ligand. Ces résines sont essentielles pour la fabrication biopharmaceutique où la réutilisation des colonnes (>100 cycles) et des exigences strictes de pureté s’appliquent.
Applications
La purification par Protéine A/G est l’étalon-or pour la purification d’anticorps dans la recherche et l’industrie. Les anticorps monoclonaux à partir de surnageants d’hybridome, les anticorps polyclonaux à partir de sérums de lapin ou de chèvre, et les anticorps monoclonaux thérapeutiques humains à partir de cultures de cellules CHO sont purifiés de routine par cette méthode. L’immunoprécipitation de complexes anticorps-antigène utilise des billes magnétiques Protéine A/G pour capturer l’anticorps, ainsi que son antigène lié. Pour les formats à haut débit, la Protéine A/G est utilisée dans la capture par affinité multiplexée et le criblage d’anticorps en plaques 96 puits.
