Aperçu
L’identification des protéines par spectrométrie de masse est la pierre angulaire de la protéomique. Le flux de travail fondamental consiste à digérer les protéines en peptides à l’aide d’une protéase telle que la trypsine, à mesurer les masses des peptides intacts (MS1), puis à fragmenter les peptides sélectionnés pour générer des spectres de masse en tandem (MS/MS) qui révèlent leur séquence d’acides aminés. Les spectres résultants sont comparés à des spectres théoriques dérivés de bases de données de séquences protéiques pour attribuer des identités. Cette approche ascendante ou ciblée est hautement évolutive et peut identifier des milliers de protéines provenant de mélanges complexes en une seule expérience.
Méthodes
La empreinte peptidique de masse (PMF) identifie les protéines en faisant correspondre la liste des masses peptidiques mesurées expérimentalement aux masses peptidiques théoriques calculées à partir d’une base de données. Le PMF fonctionne mieux pour les mélanges de protéines simples ou les protéines purifiées séparées par des techniques telles que SDS-PAGE. Identification Tandem MS (MS/MS) fragmente les peptides individuels pour produire des spectres informatifs sur la séquence. Les moteurs de recherche comparent les séries d’ions fragments observées – principalement les ions b et y – avec les séries prédites des peptides candidats. Le Séquençage de novo déduit la séquence peptidique directement à partir du spectre lorsqu’aucune correspondance dans la base de données n’est trouvée, en utilisant les différences de masse entre les ions fragments consécutifs pour dériver la séquence.
Protocole pratique
Un flux de travail typique d’identification de protéines commence par un mélange de protéines, tel qu’un complexe immunoprécipité, une bande de gel SDS-PAGE ou une fraction d’électrophorèse sur gel capillaire. Les protéines sont réduites avec du dithiothréitol (DTT) 10 mM à 56°C pendant 30 minutes, alkylées avec de l’iodoacétamide 55 mM dans l’obscurité pendant 30 minutes et digérées pendant une nuit avec de la trypsine à un rapport enzyme/substrat de 1:50 à 37°C. Les peptides résultants sont dessalés à l’aide de ZipTips C18 et chargés sur un système nanoLC couplé à un spectromètre de masse Orbitrap. L’instrument fonctionne en mode d’acquisition dépendant des données : un balayage MS1 complet de 350 à 1 600 m/z à une résolution de 70 000 identifie les 15 ions précurseurs les plus intenses, qui sont séquentiellement isolés et fragmentés par dissociation collisionnelle (HCD) à plus haute énergie à 27 % d’énergie de collision normalisée pour produire des spectres MS/MS. Les spectres de fragments sont recherchés dans une base de données de protéines à l’aide de Mascot ou SEQUEST. Chaque correspondance peptide-spectre est notée sur la base de la corrélation entre les ions fragments expérimentaux et les séries théoriques d’ions b et y. Une recherche de leurre cible estime le FDR et les correspondances sont filtrées à 1 % de FDR aux niveaux de peptide et de protéine. Le regroupement de protéines effondre les peptides qui correspondent à plusieurs protéines selon la parcimonie. Un exemple d’application concrète : l’identification de la composition du complexe des pores nucléaires humains via le fractionnement biochimique et la spectrométrie de masse a révélé plus de 30 nucléoporines, dont beaucoup n’étaient pas encore caractérisées, fournissant ainsi une image moléculaire complète du transport nucléaire. Une autre application est l’identification bactérienne par MALDI-TOF MS en microbiologie clinique, où les profils de protéines ribosomales servent d’empreintes taxonomiques pour l’identification au niveau de l’espèce en quelques minutes plutôt qu’en quelques jours.
### Candidatures
L’identification des protéines est appliquée à la biologie moléculaire et à la recherche clinique. Il confirme l’identité des protéines purifiées obtenues par extraction et purification de protéines, caractérise les composants des expériences de protéomique et spectrométrie de masse et identifie les complexes protéiques co-purifiés avec une protéine d’appât. En microbiologie, il est utilisé pour identifier les espèces bactériennes grâce à un protéotypage basé sur la spectrométrie de masse, complétant les approches génomiques.
