La chromatographie en phase inverse (RPC) sépare les molécules en fonction de l’hydrophobicité, en utilisant une phase stationnaire apolaire et une phase mobile polaire. C’est le mode de chromatographie liquide le plus utilisé en chimie analytique et en protéomique.
Principe
La phase stationnaire est constituée de chaînes alkyles (C₄, C₈, C₁₈ ou groupes phényle) liées de façon covalente à des particules de silice ou de polymère. La phase mobile est un mélange d’eau et d’un solvant organique miscible à l’eau tel que l’acétonitrile, le méthanol ou l’isopropanol. Les composés polaires interagissent faiblement avec la phase stationnaire apolaire et s’éluent tôt, tandis que les composés apolaires se partitionnent dans la phase stationnaire et s’éluent plus tard à mesure que la concentration de solvant organique augmente. La rétention est régie par l’hydrophobicité de l’analyte, décrite par le log P, le coefficient de partage octanol-eau.
Phases Stationnaires
Les colonnes C₁₈ (octadécyle) sont les plus courantes, offrant une forte rétention pour une large gamme d’analytes. Les colonnes C₈ (octyle) offrent une rétention légèrement inférieure et une sélectivité différente. Les colonnes C₄ sont préférées pour les protéines car la chaîne alkyle plus courte réduit la dénaturation. Les colonnes phényle ajoutent des interactions pi-pi aromatiques. Les particules à cœur solide (fused-core) combinent un noyau solide avec une coque poreuse, réduisant la longueur du trajet de diffusion et améliorant l’efficacité sans ultra-haute pression. Les particules entièrement poreuses de moins de 2 µm permettent les séparations UHPLC.
Phases Mobiles
La phase aqueuse est typiquement de l’eau avec 0,1 % d’acide formique (pour la SM), 0,05 % de TFA (pour les peptides) ou un tampon phosphate (pour la détection UV). La phase organique est l’acétonitrile (faible coupure UV, faible viscosité), le méthanol (viscosité plus élevée, sélectivité différente) ou l’isopropanol (éluant fort, utile pour les composés très hydrophobes). L’élution par gradient augmente la proportion organique de 5 % à 95 % en 10–60 minutes. L’élution isocratique utilise une composition constante pour les séparations simples.
Rétention et Sélectivité
Le facteur de rétention k’ décrit la force avec laquelle un analyte est retenu. La sélectivité α décrit la séparation entre deux pics. La résolution Rₛ combine rétention, sélectivité et efficacité. La longueur de la colonne, la taille des particules, le débit, la température et la pente du gradient influencent tous la résolution. L’analyse de Van Deemter de la hauteur de plateau en fonction de la vitesse linéaire aide à optimiser l’efficacité pour une colonne donnée.
Cartographie Peptidique par Digestion Trypsique
La RPC est la méthode de choix pour la cartographie peptidique en protéomique. Les protéines sont digérées par la trypsine, qui clive après les résidus lysine et arginine. Les peptides résultants sont séparés sur une colonne C₁₈ avec un gradient d’acétonitrile. Chaque protéine produit une carte peptidique caractéristique. En protéomique ascendante, la colonne RPC est couplée directement à un spectromètre de masse à ionisation par électrospray. Les colonnes RPC à nano-débit (75 µm de diamètre interne, remplies de C₁₈ de 3 µm) à 200–300 nL/min fournissent la sensibilité nécessaire pour analyser des échantillons protéiques de l’ordre du nanogramme. La séparation multidimensionnelle combine l’échange de cations forts avec la RPC dans les flux de travail MudPIT.
Dessalage
La RPC sert également d’étape de dessalage ou d’échange de tampon. Les peptides chargés sur une colonne de piégeage C₁₈ dans des conditions aqueuses sont retenus tandis que les sels et les contaminants hydrophiles passent à travers. Un court gradient élue l’échantillon nettoyé directement dans le spectromètre de masse (configuration piège-élution), améliorant la stabilité d’ionisation et la sensibilité.
Applications
La RPC est appliquée dans l’analyse pharmaceutique (pureé des médicaments, tests de stabilité), la chimie clinique (suivi thérapeutique des médicaments, profilage des stéroïdes), l’analyse alimentaire (résidus de pesticides, additifs) et l’analyse environnementale (contaminants dans l’eau). En biotechnologie, la RPC analyse les variants de protéines recombinantes, les produits de désamidation et les espèces d’oxydation critiques pour l’évaluation de la qualité des produits. La cartographie peptidique par RPC est un test de libération pour l’identité des biopharmaceutiques et la cohérence des lots.
