La purification Strep-tag utilise une courte étiquette peptidique (Strep-tag II) qui se lie spécifiquement à la streptavidine modifiée (Strep-Tactine) pour une purification douce de protéines en une étape dans des conditions physiologiques sans ions métalliques ni agents réducteurs.
Principe
Le Strep-tag II est une séquence peptidique de huit acides aminés (WSHPQFEK) qui imite l’interaction de la biotine avec la streptavidine. Il se lie à la Strep-Tactine, un variant modifié de la streptavidine avec une poche de liaison modifiée qui accueille le peptide avec une haute affinité (K_d ≈ 1 µM). La liaison est réversible : l’élution utilise 2,5 mM de desthiobiotine, un analogue de la biotine qui déplace compétitivement l’étiquette. La desthiobiotine se lie plus faiblement que la biotine et est éliminée lors de l’échange de tampon, permettant la régénération de la résine. Alternativement, 10 mM de biotine peuvent être utilisés pour une élution complète mais empêchent la réutilisation de la résine. La procédure entière est compatible avec des tampons physiologiques, préservant la structure native et l’activité de la protéine.
Twin-Strep-Tag
Le Twin-Strep-tag (deux séquences Strep-tag II en tandem séparées par un court lieur) améliore considérablement l’affinité de liaison (K_d ≈ 10⁻¹¹ M), permettant la capture de protéines exprimées à des niveaux très faibles et la purification à partir d’échantillons dilués. Il permet également la capture quantitative de complexes protéiques. Le Twin-Strep-tag est recommandé pour les cibles difficiles et pour la capture par affinité de partenaires d’interaction protéique à partir de niveaux d’expression endogènes.
Résines et Formats
L’agarose Strep-Tactine (IBA Lifesciences, maintenant faisant partie de Cube Biotech) offre une capacité de liaison d’environ 50 nmol de peptide Strep-tag II par mL (≈1,3 mg d’une protéine de 26 kDa). La résine haute performance Strep-Tactin Superflow est compatible avec les systèmes FPLC à des débits allant jusqu’à 5 mL/min. Les billes magnétiques Strep-Tactine sont disponibles pour la purification à petite échelle et les expériences de pull-down. Strep-TactinXT est une version améliorée avec une affinité plus élevée pour le Strep-tag II conventionnel, éliminant le besoin du plus grand Twin-Strep-tag dans la plupart des applications.
Tampons
Tampon de chargement/lavage : 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Tampon d’élution : tampon de chargement plus 2,5 mM de desthiobiotine. Tampon de régénération : 1 mM HABA (acide hydroxyazophényl-benzoïque) ou 10 mM de biotine dans le tampon de chargement pour éliminer les protéines résiduelles liées ou la desthiobiotine. Le tampon est compatible avec les agents réducteurs (< 2 mM DTT ou TCEP) et les détergents doux (0,1 % Triton X-100, 0,05 % NP-40). Les agents réducteurs forts (> 10 mM DTT) et les solutions contenant de la biotine (> 2 µM) doivent être évités dans l’étape de chargement car ils interfèrent avec la liaison.
Protocole
Équilibrer la résine Strep-Tactine avec le tampon de chargement. Charger le lysat clarifié (incubation en batch 30 min, 4 °C, ou colonne à 0,5–1 mL/min). Laver avec 10–20 volumes de colonne de tampon de chargement. Éluer avec 6–10 volumes de colonne de tampon d’élution (desthiobiotine). En cas d’utilisation de biotine, éluer avec 5 volumes de colonne et noter que la résine ne peut pas être réutilisée. Régénérer avec du tampon HABA ou biotine, puis équilibrer pour une réutilisation jusqu’à cinq fois. Collecter les fractions et analyser par SDS-PAGE.
Avantages
Le Strep-tag est petit (8 acides aminés, 1 kDa) et affecte rarement la fonction protéique, rendant le retrait de l’étiquette inutile pour la plupart des applications. L’élution avec la desthiobiotine dans des conditions physiologiques préserve l’activité enzymatique, l’intégrité du complexe et la liaison des anticorps. Le système est compatible avec His-tag pour les purifications à double étiquette. L’absence d’ions métalliques élimine le risque d’oxydation catalysée par les métaux. Les applications incluent la purification de protéines recombinantes, l’isolement de complexes protéiques et le pull-down de partenaires d’interaction.
