La résonance plasmonique de surface (SPR) mesure la liaison et la dissociation des molécules en temps réel sans marqueurs fluorescents ou radioactifs. C’est l’étalon-or pour déterminer l’affinité de liaison (KD), les constantes d’association (ka) et de dissociation (kd).

Principe

La SPR détecte les changements d’indice de réfraction à la surface d’un capteur en or. Un interactant (le ligand) est immobilisé sur la surface du capteur. Une solution contenant l’autre interactant (l’analyte) s’écoule sur la surface. Lorsque les molécules d’analyte se lient au ligand, la masse à la surface augmente, modifiant l’indice de réfraction. Ce changement est mesuré en continu et tracé sous forme de sensorgramme (réponse en unités de résonance en fonction du temps).

Sensorgramme

Une expérience SPR typique comprend :

1. Ligne de base : le tampon s’écoule sur la surface.
2. Association : l’analyte est injecté ; la réponse augmente à mesure que la liaison se produit.
3. Équilibre : la vitesse de liaison égale la vitesse de dissociation ; la réponse atteint un plateau.
4. Dissociation : le tampon remplace l’analyte ; la réponse diminue à mesure que le complexe se dissocie.

Plusieurs concentrations d’analyte sont injectées sur la même surface de ligand pour générer une série de sensorgrammes. L’ajustement global des données à un modèle de liaison 1:1 donne ka, kd et le KD calculé (= kd/ka).

Instrumentation

Le Biacore (Cytiva) est la plateforme SPR la plus utilisée. La puce capteur a une surface en or recouverte d’une matrice de dextrane carboxyméthylée qui fournit un environnement hydrophile pour l’immobilisation. D’autres plateformes incluent Sierra Sensors, Reichert et Nicoya.

Méthodes d’Immobilisation

• Couplage amine : la méthode la plus courante. Les groupes carboxyle sur la surface de dextrane sont activés avec EDC/NHS pour former des esters réactifs qui réagissent avec les amines primaires du ligand. Simple mais orientation aléatoire.
• Couplage par capture : une molécule de capture (anticorps anti-His, streptavidine, Protéine A) est couplée par amine, et le ligand est capturé à partir d’une préparation brute ou purifiée. Cela assure une orientation uniforme et permet la régénération de la surface sans endommager le ligand.
• Biotine–streptavidine : les ligands biotinylés sont capturés sur une surface recouverte de streptavidine. Stabilité quasi-covalente avec immobilisation orientée.

Applications

• Classement d’affinité : criblage des clones d’anticorps pour la plus haute affinité.
• Regroupement d’épitopes : détermination si deux anticorps se lient à des épitopes chevauchants.
• Analyse de concentration : mesure de la concentration active en utilisant une approche sans calibration.
• Analyse des petites molécules : les instruments SPR modernes détectent des molécules aussi petites que 100 Da.
• Caractérisation cinétique : détermination complète de ka, kd et KD pour les candidats médicaments.

Limitations

La SPR nécessite un ligand relativement pur et la connaissance de la stœchiométrie de liaison. La limitation du transport de masse (l’analyte se lie plus vite qu’il ne peut diffuser vers la surface) peut fausser la cinétique et est traitée en utilisant des débits élevés et de faibles densités de ligand. La liaison non spécifique à la surface ou à la matrice doit être minimisée en optimisant le tampon de migration (ajout de surfactant, de BSA ou de glycérol).