Au-delà de l’édition CRISPR/Cas9 de base, l’ingénierie génomique comprend le criblage fonctionnel en pool et des nucléases alternatives pour une modification précise de la séquence.

Criblage CRISPR

Le criblage CRISPR est une méthode de génomique fonctionnelle à haut débit qui utilise des banques lentivirales poolées d’ARN guides uniques (ARNsg) pour inactiver chaque gène du génome et identifier ceux impliqués dans un phénotype d’intérêt.

Un criblage typique :

1. Une banque d’ARNsg lentivirale (par exemple, la banque Brunello : 4 ARNsg par gène, 77 000 ARNsg au total) est transduite dans des cellules exprimant Cas9 à une faible multiplicité d’infection (~0,3) pour garantir que la plupart des cellules reçoivent un ARNsg.
2. Les cellules sont soumises à une pression de sélection : traitement médicamenteux, exposition à une toxine ou un phénotype basé sur le tri (par exemple, un rapporteur pour une voie de signalisation).
3. L’ADN génomique est extrait, et les séquences d’ARNsg sont amplifiées par PCR et quantifiées par séquençage de nouvelle génération.
4. Les ARNsg appauvris ou enrichis dans le groupe traité par rapport au contrôle identifient les gènes essentiels à la survie ou à la résistance.

Les cribles CRISPR sont plus sensibles et spécifiques que les cribles shARN car Cas9 crée des inactivations complètes et a moins d’effets hors cible.

TALENs

Les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs) sont des enzymes de restriction artificielles fabriquées en fusionnant un domaine de liaison à l’ADN effecteur TAL avec le domaine nucléase de FokI. Chaque répétition d’effecteur TAL reconnaît une seule paire de bases d’ADN, permettant un assemblage modulaire de domaines de liaison qui ciblent n’importe quelle séquence.

Le domaine FokI doit se dimériser, donc les TALENs sont utilisés par paires flanquant le site cible. La dimérisation crée une cassure double brin (CDB) au niveau de la cible, qui est réparée par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) — produisant de petites insertions ou délétions — ou par réparation dirigée par homologie (HDR) si une matrice de réparation est fournie.

Les TALENs sont plus spécifiques que les premiers systèmes CRISPR mais plus laborieux à construire car chaque nouvelle cible nécessite l’assemblage d’un nouveau réseau de répétitions.

Nucléases à Doigts de Zinc (ZFN)

Les ZFN fusionnent des domaines à doigts de zinc (chacun reconnaissant ~3 pb) au domaine nucléase de FokI. Comme les TALENs, ils nécessitent des sites de liaison appariés et la dimérisation de FokI pour leur activité. Les ZFN ont été les premières nucléases ciblées largement utilisées mais ont été largement supplantées par CRISPR et les TALENs en raison de la difficulté à concevoir des réseaux de doigts de zinc avec une haute spécificité.

Choix d’une Approche

• CRISPR est le plus simple et le plus évolutif — adapté aux cribles à l’échelle du génome et à l’édition de routine.
• Les TALENs offrent une édition hors cible plus faible et sont préférés lorsqu’une reconnaissance précise d’une seule base est nécessaire ou lors de l’édition dans des organismes où les contraintes PAM de CRISPR sont limitantes.
• Les ZFN restent utiles dans des contextes spécifiques tels que la thérapie génique (où une taille plus petite facilite le conditionnement viral) et dans les organismes où les autres outils sont moins développés.