L’électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide sépare des mélanges protéiques complexes par point isoélectrique dans la première dimension et par poids moléculaire dans la seconde dimension, produisant une carte à haute résolution de centaines à milliers de spots protéiques dans un seul gel.
Principe
La 2D-PAGE combine deux principes de séparation orthogonaux. Dans la première dimension, les protéines sont séparées par focalisation isoélectrique selon leur charge nette. Dans la seconde dimension, elles sont séparées par poids moléculaire via SDS-PAGE, identique à une SDS-PAGE unidimensionnelle standard. Le résultat est un réseau bidimensionnel de spots, chacun correspondant à une isoforme protéique ou un état de modification spécifique.
Première Dimension — Focalisation Isoélectrique
Les échantillons sont solubilisés dans un tampon contenant de l’urée, de la thiourée, du détergent CHAPS, du DTT et des ampholytes porteurs. Les bandes à gradient de pH immobilisé fournissent un gradient de pH stable et reproductible allant d’étroit (pH 4–7) à large (pH 3–10). La bande est réhydratée avec l’échantillon, puis focalisée à tension croissante (300–8000 V) pendant plusieurs heures à des dizaines de kilovolt-heures. Les protéines migrent jusqu’au pH où leur charge nette est nulle — leur point isoélectrique. Les bandes focalisées sont équilibrées dans du DTT (réduction) suivi d’iodoacétamide (alkylation) avant la seconde dimension.
Deuxième Dimension — SDS-PAGE
La bande équilibrée est placée sur le dessus d’un gel de polyacrylamide et scellée avec de l’agarose. Les protéines enrobées de SDS migrent verticalement à travers le gel, se séparant par poids moléculaire. Les gels Laemmli standard ou les gels gradient (par exemple, 8–16 % d’acrylamide) améliorent la résolution sur la gamme de masse. Les marqueurs de poids moléculaire sont chargés à une extrémité. Les protéines sont visualisées par bleu de Coomassie, coloration à l’argent, SYPRO Ruby ou marquage par fluorescence.
Préparation des Échantillons
La qualité de l’échantillon est critique pour des gels 2D reproductibles. Les inhibiteurs de protéase et de phosphatase sont essentiels. Les protéines sont précipitées avec du TCA/acétone ou à l’aide de kits de purification pour éliminer les sels, lipides et acides nucléiques qui interfèrent avec la focalisation. Les échantillons sont quantifiés par test Bradford ou BCA. Pour les protéines membranaires, des détergents supplémentaires ou des solvants organiques améliorent la solubilisation.
Détection et Analyse
Les gels sont scannés par densitométrie et analysés avec des logiciels tels que PDQuest, Delta2D ou Melanie. La détection des spots, l’appariement entre gels et la normalisation génèrent des données d’abondance quantitative. Les spots différentiellement exprimés sont identifiés par des tests statistiques. Les spots d’intérêt sont excisés et identifiés par spectrométrie de masse après digestion trypsique dans le gel.
Avantages et Limitations
La 2D-PAGE résout les protéines intactes avec des modifications post-traductionnelles, qui déplacent les spots horizontalement (phosphorylation, acétylation) ou verticalement (glycosylation). Les limites de détection sont de 1 ng par spot avec la coloration à l’argent et de 100 ng avec le Coomassie. Les limitations incluent une mauvaise représentation des protéines très acides ou basiques (pI < 3 ou > 10), des protéines membranaires (l’hydrophobicité s’agrège pendant la focalisation), des protéines de très haut et très bas poids moléculaire (> 200 kDa ou < 10 kDa) et des protéines de faible abondance qui tombent en dessous du seuil de détection. La reproductibilité nécessite une standardisation minutieuse à toutes les étapes.
Applications
La 2D-PAGE est une pierre angulaire de la protéomique pour l’analyse d’expression différentielle, comparant les tissus sains et malades, les lignées cellulaires traitées et non traitées, ou les stades de développement. Elle cartographie les isoformes protéiques et les modifications post-traductionnelles, fournissant un instantané du protéome fonctionnel. L’électrophorèse sur gel 2D différentielle utilise le marquage CyDye (Cy3, Cy5, Cy2) pour faire migrer deux ou trois échantillons dans le même gel, éliminant la variabilité gel-à-gel et améliorant la précision quantitative.
