La spectroscopie UV-Vis (Ultraviolet-Visible) est une technique analytique qui mesure l’absorption de la lumière dans les régions ultraviolette (190-400 nm) et visible (400-800 nm) du spectre électromagnétique. Il est largement utilisé pour l’analyse quantitative, les études cinétiques et la caractérisation des transitions électroniques dans les molécules.

Principe d’absorption UV-Vis

Lorsque la lumière traverse un échantillon, les molécules absorbent des photons dont l’énergie correspond à l’écart énergétique entre les orbitales électroniques, faisant ainsi passer les électrons de l’état fondamental à un état excité. La quantité de lumière absorbée à chaque longueur d’onde est enregistrée sous forme de spectre d’absorbance et la longueur d’onde d’absorption maximale (λmax) est caractéristique de chaque chromophore. La loi de Beer-Lambert (A = εcl) relie l’absorbance (A) à l’absorptivité molaire (ε), à la longueur du trajet (c) et à la concentration (l), permettant la quantification.

###Instruments Un spectromètre UV-Vis comprend plusieurs composants. Une lampe au deutérium fournit de la lumière pour le domaine UV et une lampe tungstène-halogène pour le domaine visible. Un monochromateur (réseau de diffraction ou prisme) sélectionne une bande étroite de longueurs d’onde. Le compartiment à échantillons contient une cuvette en quartz pour les mesures UV ou une cuvette en verre pour les mesures dans le visible, et un détecteur (tube photomultiplicateur ou réseau de photodiodes) convertit la lumière transmise en un signal électrique. Les instruments à double faisceau divisent la lumière en faisceaux d’échantillon et de référence pour corriger les fluctuations du solvant et de la lampe.

### Candidatures La spectroscopie UV-Vis est utilisée pour l’analyse quantitative des acides nucléiques (A260), des protéines (A280) et de la cinétique des enzymes, la détermination des valeurs de pKa en mesurant les changements d’absorbance avec le pH, le contrôle qualité des produits pharmaceutiques, des colorants alimentaires et des polluants de l’eau, et la caractérisation des complexes de métaux de transition et des composés organiques conjugués.

Avantages et limites

• Avantages : Rapide, non destructif, nécessite de petits volumes d’échantillons et est relativement peu coûteux.
• Limitations : Mesure uniquement les espèces chromophores ; les échantillons doivent être transparents et exempts de particules diffusantes.

Protocole pratique de spectroscopie UV-Vis

Réchauffez l’instrument pendant 15 à 30 minutes pour stabiliser la lampe. Sélectionnez des cuvettes en quartz pour les mesures UV (<350 nm) puisque le verre et le plastique absorbent la lumière UV ; utilisez des cuvettes jetables en plastique ou en verre pour les mesures dans la plage visible uniquement. Manipulez les cuvettes par les côtés dépolis pour éviter les empreintes digitales sur les fenêtres optiques. Remplissez une cuvette de référence avec la solution à blanc (le solvant ou le tampon seul) et la cuvette d’échantillon avec la solution à analyser. Insérez la cuvette de référence dans le trajet du faisceau de référence et l’échantillon dans le trajet du faisceau d’échantillon. Pour les instruments à faisceau unique, collectez d’abord un spectre de base du blanc, puis remplacez-le par l’échantillon. Effectuez un balayage de longueur d’onde de 200 à 800 nm à vitesse moyenne (200 nm/min) pour déterminer λmax — la longueur d’onde d’absorbance maximale. Pour une analyse quantitative à une longueur d’onde fixe, réglez l’instrument sur le λmax de l’analyte. Mesurez l’absorbance d’une série de solutions étalons (5 à 7 concentrations couvrant la plage attendue) et de l’échantillon inconnu. Construisez une courbe d’étalonnage en traçant l’absorbance en fonction de la concentration. Ajustez une régression linéaire — la loi de Beer-Lambert (A = εbc) stipule que la relation doit être linéaire avec une ordonnée à l’origine proche de zéro, à condition que l’absorbance soit comprise entre 0,1 et 1,0 (la plage linéaire de la plupart des instruments). Si l’absorbance dépasse 1,0, diluez l’échantillon. Pour la quantification de l’ADN à 260 nm, utilisez le coefficient d’extinction de 50 ng/µL par unité OD pour l’ADN double brin et de 33 ng/µL par unité OD pour l’ADN simple brin. La pureté est évaluée par le rapport A260/A280 (~1,8 pour l’ADN pur, ~2,0 pour l’ARN pur) et le rapport A260/A230 (>2,0). Pour la quantification des protéines à 280 nm, mesurez l’A280 d’une protéine purifiée et calculez la concentration à l’aide du coefficient d’extinction molaire de la protéine. Pour la cinétique enzymatique, surveillez l’évolution de l’absorbance au fil du temps à une longueur d’onde fixe – par exemple, la consommation de NADH à 340 nm (ε = 6 220 M⁻¹cm⁻¹) pour mesurer l’activité de la déshydrogénase.

Application du monde réel

Dans une étude de l’enzyme alcool déshydrogénase, l’oxydation de l’éthanol en acétaldéhyde est couplée à la réduction du NAD⁺ en NADH, qui absorbe à 340 nm. La réaction est surveillée à 340 nm pendant 5 minutes à 30°C avec 0,1 à 10 mM d’éthanol. Les vitesses initiales sont tracées en fonction de la concentration du substrat et ajustées à l’équation de Michaelis-Menten, ce qui donne Km = 1,2 mM et Vmax = 85 µM/min.