La cristallographie aux rayons X détermine la structure atomique tridimensionnelle des protéines et autres macromolécules en mesurant les angles et les intensités des rayons X diffractés par un cristal, puis en calculant des cartes de densité électronique à partir desquelles des modèles atomiques sont construits.

Principe

Lorsque les rayons X frappent un cristal, ils sont diffusés par les nuages électroniques des atomes. Le réseau régulièrement espacé du cristal provoque une interférence constructive — la diffraction — à des angles spécifiques décrits par la loi de Bragg. La mesure des positions et des intensités des taches de diffraction permet la reconstruction de la distribution de densité électronique. Cette carte de densité est ensuite interprétée en ajustant un modèle atomique, qui est affiné par rapport aux données observées.

Cristallisation des Protéines

La diffraction nécessite des cristaux avec un ordre tridimensionnel régulier. La protéine est purifiée à >95 % d’homogénéité à 5–20 mg/mL. Les cribles de cristallisation testent des centaines de conditions variant le précipitant (PEG, sulfate d’ammonium), le pH, le tampon, le sel et les additifs. La diffusion de vapeur en goutte assise et en goutte suspendue sont les méthodes standard. Des gouttelettes de protéine et de solution de réservoir s’équilibrent contre un réservoir plus grand, concentrant la protéine et favorisant la nucléation. Les cristaux adaptés à la diffraction se développent sur des jours à des semaines et sont récoltés avec des cryo-boucles.

Collecte de Données

Les cristaux sont refroidis rapidement dans l’azote liquide à 100 K pour réduire les dommages par radiation. Les données de diffraction sont collectées sur des lignes de lumière synchrotron, qui fournissent des faisceaux de rayons X intenses et accordables. Un ensemble de données complet comprend des centaines à des milliers d’images de diffraction collectées tandis que le cristal tourne sur une petite plage angulaire par image. Le traitement des données avec XDS, iMosflm ou DIALS indexe les réflexions, intègre les intensités et met à l’échelle les mesures. Les limites de résolution sont définies par les réflexions aux plus grands angles avec une intensité mesurable ; 2,0–3,0 Å est typique pour les structures de protéines.

Problème de Phase

Les intensités mesurées fournissent les amplitudes mais pas les phases, qui sont essentielles pour la transformée de Fourier qui reconstruit la densité électronique. Le remplacement moléculaire résout les phases en plaçant un modèle de structure homologue dans la maille cristallographique et en calculant sa diffraction prédite, ce qui fournit les phases initiales. Lorsqu’aucun bon modèle de recherche n’existe, le phasage expérimental utilise des dérivés d’atomes lourds (MIRAS) ou l’incorporation de sélénium via la sélénométhionine (MAD/SAD). Les pipelines modernes automatisent la majeure partie de ce processus.

Construction et Affinement du Modèle

La carte de densité électronique initiale est interprétée dans Coot ou un logiciel similaire, où la chaîne polypeptidique est tracée et les chaînes latérales sont placées. Le modèle subit des cycles itératifs d’ajustement manuel et d’affinement computationnel avec phenix.refine ou REFMAC5. L’affinement optimise le modèle pour minimiser la différence entre les facteurs de structure calculés et observés. La qualité est surveillée par Rwork et Rfree. Une structure fiable a typiquement un Rfree inférieur à 0,25 à une résolution de 2,5 Å.

Validation

MolProbity valide la géométrie du squelette, les rotamères aberrants, les scores de clash et les statistiques de Ramachandran. La corrélation entre le modèle et la densité électronique expérimentale est évaluée par le facteur R dans l’espace réel. Le rapport de validation PDB, généré pour tous les dépôts, fournit un résumé de qualité standardisé. Critères recommandés : >90 % Ramachandran favorisés, <0,3 % Ramachandran aberrants, <1 % rotamères aberrants.

Applications

La cristallographie aux rayons X a déterminé la majorité des structures protéiques connues dans la Protein Data Bank. Elle a élucidé les mécanismes catalytiques des enzymes, les interactions médicament-cible incluant la protéase du VIH et les inhibiteurs de kinases, et de grands complexes macromoléculaires tels que le ribosome. Avec la spectroscopie RMN et la cryo-ME, elle forme la boîte à outils centrale de la biologie structurale.