Isoler une culture bactérienne pure d’un échantillon mixte est la première étape de tout workflow microbiologique — que ce soit pour le diagnostic clinique, les tests de sécurité alimentaire ou la recherche.

Milieux de Culture

Les bactéries sont cultivées dans des formulations riches en nutriments qui fournissent du carbone, de l’azote, des minéraux et des sources d’énergie. Les milieux sont classés par composition :

• Milieux définis (synthétiques) : chaque composant chimique est connu. Utilisés pour les études métaboliques.
• Milieux complexes : contiennent des digestats de matière animale ou végétale (peptone, tryptone, extrait de levure). Le bouillon LB (Luria-Bertani) est le milieu complexe le plus courant pour E. coli.
• Milieux sélectifs : contiennent des inhibiteurs (antibiotiques, sels biliaires, colorants) qui suppriment les bactéries indésirables tout en permettant la croissance de l’organisme cible. Exemples : gélose MacConkey (sélectionne les bactéries Gram-négatif), gélose au sel de mannitol (sélectionne les staphylocoques).
• Milieux différentiels : contiennent des indicateurs qui distinguent les types bactériens. La gélose MacConkey est à la fois sélective et différentielle — les fermenteurs de lactose deviennent roses, les non-fermenteurs restent incolores.
• Milieux enrichis : supplémentés en sang, sérum ou facteurs de croissance pour soutenir les organismes exigeants. La gélose au sang (5 % de sang de mouton) est le milieu enrichi le plus courant.

Ensemencement par Stries

La méthode des quadrants isole des colonies uniques à partir d’une culture mixte :

1. Stérilisez une anse d’inoculation en la chauffant au rouge, puis refroidissez en touchant le bord stérile de la gélose.
2. Prélevez une petite quantité de l’échantillon bactérien.
3. Striez le premier quadrant en un motif zigzag serré.
4. Flambez l’anse, refroidissez, et traversez le premier quadrant vers le second.
5. Répétez pour les troisième et quatrième quadrants, en flambant entre chaque.
6. Incubez à l’envers à la température appropriée (37 °C pour la plupart des pathogènes, 30 °C pour les isolats environnementaux).

Après incubation, des colonies isolées apparaissent le long des stries des quadrants finaux là où la densité cellulaire est la plus faible.

Technique de l’Étalement et de l’Incorporation

La technique de l’étalement distribue uniformément une suspension bactérienne diluée sur la surface d’une gélose à l’aide d’un étaleur en verre stérile. Elle est utilisée pour quantifier les comptages bactériens (UFC/mL).

La technique d’incorporation mélange l’échantillon dilué avec de la gélose fondue avant de couler dans la boîte. Les colonies se développent à la fois sur la surface et à l’intérieur de la gélose. Elle est utile pour compter les organismes tolérants à la chaleur et pour détecter de faibles nombres d’organismes.

Conditions d’Incubation

L’incubation standard est à 37 °C à l’air libre pendant 18–24 heures. Les variantes incluent :

• Capnophile : 5–10 % de CO₂ (certains pathogènes, par exemple, Neisseria).
• Anaérobie : atmosphère sans oxygène utilisant un jarre ou une chambre anaérobie (par exemple, Clostridium, Bacteroides).
• Microaérophile : faible teneur en oxygène, CO₂ élevé (par exemple, Campylobacter).
• Thermophile : 55–60 °C (Thermus aquaticus).