La chromatographie sur colonne est la méthode de purification la plus utilisée en chimie organique. Elle sépare les composés en fonction de leur partition différentielle entre une phase mobile (solvant) et une phase stationnaire (adsorbant).
Phases Stationnaires
- Gel de silice (SiO₂) : la phase stationnaire la plus courante. Elle est polaire et retient plus fortement les composés polaires. Les tailles de particules vont de 40–63 µm pour la chromatographie flash à 15–40 µm pour la HPLC.
- Alumine (Al₂O₃) : disponible sous formes basique, neutre et acide. Moins courante que la silice mais utile pour les composés sensibles aux bases et les séparations où la silice provoque une dégradation.
- Silice en phase inverse C18 : silice modifiée avec des chaînes octadécyle (C18), la rendant non polaire. Utilisée avec des phases mobiles polaires (eau, méthanol, acétonitrile). La chromatographie en phase inverse est la norme pour la séparation des composés non polaires à modérément polaires.
Phase Mobile (Éluant)
Le système de solvant est choisi par chromatographie sur couche mince (CCM). L’objectif est un Rf de 0,2–0,4 pour le composé cible. Commencez avec un solvant non polaire (hexane, éther de pétrole) et ajoutez un modificateur polaire (acétate d’éthyle, méthanol) en proportions croissantes. L’élution par gradient — commencer avec une faible polarité et augmenter progressivement — donne la meilleure séparation.
Chromatographie Flash
La chromatographie flash utilise de l’air comprimé ou de l’azote pour pousser le solvant à travers la colonne à 1–10 bar, réduisant le temps de séparation de quelques heures à quelques minutes. Les systèmes flash modernes (Biotage, Teledyne Isco) utilisent des cartouches pré-remplies avec une pompe à gradient et un détecteur UV intégré qui collecte automatiquement les fractions lorsqu’un pic est détecté.
Configuration manuelle de la flash :
- Remplissez une colonne en verre avec de la silice — soit par voie sèche (tasser pour tasser) ou par voie humide (verser une suspension silice–solvant).
- Appliquez l’échantillon sous forme de solution concentrée ou adsorbé sur une petite quantité de silice (charge sèche).
- Ajoutez une couche de sable sur le dessus pour protéger la surface de silice.
- Appliquez une pression de solvant et collectez les fractions dans des tubes.
- Analysez les fractions par CCM. Combinez les fractions pures et évaporez.
Collecte et Détection des Fractions
Les fractions sont généralement de 5–20 mL selon la taille de la colonne et la difficulté de séparation. La CCM est la méthode standard pour déterminer quelles fractions contiennent le composé désiré. Les composés actifs aux UV peuvent être détectés sous une lampe UV à 254 nm. La coloration de la plaque CCM avec KMnO₄, p-anisaldéhyde ou molybdate d’ammonium cérique visualise les composés non actifs aux UV.
Phase Normale vs. Phase Inverse
La phase normale (silice, phase mobile non polaire) sépare par polarité — les composés non polaires s’éluent en premier. La phase inverse (C18, phase mobile polaire) sépare par hydrophobicité — les composés polaires s’éluent en premier. La phase inverse domine en HPLC analytique mais est moins courante en purification organique préparative, où la silice en phase normale reste la norme.
