Le test immuno-enzymatique (ELISA) est un test immunologique sur plaque utilisé pour détecter et quantifier des protéines, des anticorps, des hormones et d’autres molécules spécifiques. Il combine la spécificité des anticorps avec la sensibilité de la détection basée sur les enzymes.
Comment fonctionne l’ELISA
- Revêtement
Une plaque de microtitration est recouverte d’un antigène ou d’un anticorps de capture. La molécule cible se lie à la surface par adsorption passive. La plaque est incubée toute la nuit puis lavée pour éliminer le matériel non lié.
- Blocage
Une solution de blocage contenant une protéine non pertinente telle que la BSA ou la caséine est ajoutée aux puits. Cela couvre tous les sites de liaison restants sur la surface de la plaque, empêchant ainsi la liaison non spécifique dans les étapes suivantes.
- Anticorps de détection
Un anticorps de détection conjugué à une enzyme, le plus souvent la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP), est ajouté. Dans un ELISA sandwich, un anticorps primaire se lie à la cible et un anticorps secondaire lié à une enzyme se lie au primaire.
- Génération de signaux
Un substrat pour l’enzyme est ajouté. L’enzyme convertit le substrat en un produit coloré, fluorescent ou luminescent. La réaction est laissée se dérouler pendant un temps déterminé puis arrêtée.
- Mesure
Le signal est mesuré à l’aide d’un lecteur de plaque. L’intensité du signal est proportionnelle à la quantité de molécule cible dans l’échantillon. Une courbe étalon utilisant des concentrations connues permet la quantification.
- Formats ELISA
- ELISA direct : l’antigène est recouvert et un anticorps lié à une enzyme le détecte directement.
- ELISA indirect : l’antigène est recouvert, un anticorps primaire se lie et un anticorps secondaire lié à une enzyme le détecte.
- Sandwich ELISA : Un anticorps de capture est enrobé, l’antigène se lie et un anticorps de détection complète le sandwich.
- ELISA compétitif : le signal diminue à mesure que la concentration cible augmente.
Protocole ELISA sandwich pratique
Enduire une plaque de microtitration à liaison élevée de 96 puits avec 100 µL/puits d’anticorps de capture dilué dans un tampon de revêtement (tampon carbonate-bicarbonate 0,1 M pH 9,6) à une concentration de 1 à 5 µg/mL. Incuber toute la nuit à 4°C. Laver la plaque 3 fois avec 300 µL/puits de PBST (PBS + 0,05 % Tween-20) à l’aide d’un laveur de plaques ou d’une pipette multicanal. Bloquer chaque puits avec 200 µL de tampon de blocage (PBST contenant 3 % de BSA ou 5 % de lait sec écrémé) pendant 1 heure à température ambiante. Laver 3 fois. Ajouter 100 µL/puits d’étalons (dilutions en série de la protéine cible, généralement 7 concentrations allant de 1 000 pg/mL à 15 pg/mL) et des échantillons, chacun en double. Incuber 2 heures à température ambiante. Laver 5 fois. Ajouter 100 µL/puits d’anticorps de détection (biotinylé ou directement conjugué à une enzyme) à la concentration optimisée (généralement 0,5 à 2 µg/mL). Incuber 1 heure à température ambiante. Laver 5 fois. Si vous utilisez un anticorps de détection biotinylé, ajoutez 100 µL/puits de streptavidine-HRP (1:2000) pendant 30 minutes et lavez 5 fois. Ajouter 100 µL/puits de solution de substrat TMB et incuber dans l’obscurité pendant 15 à 30 minutes. Arrêtez la réaction avec 50 µL/puits de 2N H2SO4. Mesurez l’absorbance à 450 nm avec un lecteur de plaque dans les 30 minutes. Générez une courbe standard en traçant l’absorbance par rapport à la concentration logarithmique et ajustez un modèle logistique à 4 paramètres (4PL) ou à 5 paramètres. Calculez les concentrations d’échantillon en interpolant à partir de la courbe standard. Les courbes acceptables ont un R² > 0,98 et des concentrations standard rétrocalculées comprises entre 70 et 130 % des valeurs attendues.
Application du monde réel
Un ELISA sandwich pour le TNFα humain dans le sérum du patient utilise un anticorps de capture monoclonal et un anticorps de détection polyclonal. Le test a une plage de détection de 15 à 1 000 pg/mL avec une limite de quantification de 20 pg/mL. Le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde présente des taux de TNFα de 85 ± 32 pg/mL (n = 24) contre 12 ± 7 pg/mL chez les témoins sains, confirmant le TNFα comme biomarqueur de l’inflammation et soutenant les décisions thérapeutiques anti-TNFα.
