L’épigénomique étudie les motifs à l’échelle du génome de la méthylation de l’ADN, des modifications des histones et de l’accessibilité de la chromatine. Deux des techniques épigénomiques les plus utilisées sont l’ATAC-seq et le séquençage au bisulfite.
ATAC-Seq
L’ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) cartographie les régions de chromatine ouverte — l’ADN dépourvu de nucléosomes où les facteurs de transcription et autres protéines régulatrices se lient. Elle utilise la transposase Tn5 hyperactive, qui fragmente simultanément l’ADN et insère des adaptateurs de séquençage dans les régions de chromatine accessibles.
Le protocole est remarquablement simple :
- Collectez 50 000 cellules (fraîches ou cryoconservées).
- Lysez les membranes cellulaires pour libérer les noyaux.
- Incubez les noyaux avec la transposase Tn5 chargée d’adaptateurs de séquençage pendant 30 minutes à 37 °C.
- Purifiez l’ADN tagmenté, amplifiez par PCR avec des amorces à code-barres et séquencez en paired-end sur une plateforme Illumina.
Les lectures sont alignées sur le génome de référence, et les pics d’activité de la transposase indiquent une chromatine ouverte. Ces pics sont enrichis au niveau des promoteurs, des enhancers et d’autres éléments régulateurs. L’ATAC-seq peut également déduire le positionnement des nucléosomes et les empreintes de liaison des facteurs de transcription à partir du profil des longueurs de fragments.
Les principaux avantages sont la rapidité (la préparation complète de la bibliothèque prend 2–3 heures) et les faibles besoins en quantité d’entrée (jusqu’à 500 cellules, et même l’ATAC-seq unicellulaire est maintenant courante).
Séquençage au Bisulfite
Le séquençage au bisulfite détecte la 5-méthylcytosine (5mC) dans l’ADN. Le traitement au bisulfite de sodium convertit les cytosines non méthylées en uracile (qui est lu comme thymine après PCR), tandis que les cytosines méthylées restent inchangées. La séquence résultante est comparée à une référence pour déterminer le statut de méthylation à résolution de base unique.
Le séquençage au bisulfite du génome entier (WGBS) fournit une carte complète de la méthylation mais coûte cher. Le séquençage au bisulfite à représentation réduite (RRBS) utilise la digestion par MspI pour enrichir les régions riches en CpG, réduisant le coût de séquençage. Le séquençage ciblé au bisulfite amplifie des régions d’intérêt spécifiques, comme les îlots CpG promoteurs.
Considérations clés :
- Le traitement au bisulfite dégrade l’ADN. Commencez avec 100–500 ng d’ADN de haute qualité.
- L’efficacité de conversion doit être >99 %. Des contrôles d’ADN lambda non méthylé permettent de calculer le taux de conversion.
- L’alignement nécessite un aligneur compatible bisulfite (Bismark, BSMAP ou BWA-meth) qui mappe les lectures sur une référence convertie au bisulfite.
- La méthylation est rapportée sous forme de valeurs β (0 à 1) ou de valeurs M pour chaque site CpG.
Points Communs de l’Analyse des Données
L’ATAC-seq et le séquençage au bisulfite produisent tous deux des fichiers FASTQ qui sont alignés sur le génome de référence. Pour l’ATAC-seq, l’appel de pics utilise MACS2 ou Genrich ; pour les données de bisulfite, l’appel de méthylation utilise des scripts dans le pipeline Bismark. Les métriques de qualité incluent la fraction de lectures dans les pics (FRiP) pour l’ATAC-seq et le taux de conversion au bisulfite pour les données de méthylation.
