La fixation est la première et la plus importante étape de la préparation des tissus. Elle prévient l’autolyse et la putréfaction, préserve la morphologie cellulaire et tissulaire, durcit le tissu pour la manipulation et protège les composants biochimiques pour la coloration et l’analyse en aval. La qualité de la fixation détermine la qualité de tout ce qui suit.
Principes de la Fixation
Le fixateur idéal pénètre rapidement le tissu, inactive les enzymes autolytiques, précipite ou réticule les protéines, préserve les glucides et les lipides, ne rétrécit ni ne gonfle excessivement le tissu, permet une coloration ultérieure et ne présente pas de danger pour le personnel. Aucun fixateur unique ne satisfait toutes ces exigences. La cinétique de la fixation suit les lois de la diffusion : la taille de l’échantillon et la concentration du fixateur déterminent la vitesse de pénétration. Le formol neutre tamponné (FNBT, 10% de formol du commerce dans un tampon phosphate, pH 7,0) pénètre d’environ 0,5 à 1 mm par heure à température ambiante. La fixation par perfusion — pompage du fixateur dans le système vasculaire — est la méthode la plus rapide et la plus uniforme, utilisée en autopsie et en recherche animale.
Chimie du Formol
Le formol est du gaz formaldéhyde dissous dans l’eau (37-40%).
Dans les tissus, le formaldéhyde forme des ponts méthylène entre les groupes amino, imino, amide, guanidinyle, hydroxyle, phényle et sulfhydryle des protéines, ainsi qu’avec les groupes amino des acides nucléiques et des glucides. La réaction crée un réseau de protéines réticulées qui préserve la morphologie mais réduit l’accessibilité des antigènes pour l’IHC (nécessitant une récupération antigénique) et provoque une fragmentation de l’ADN/ARN (limitant la biologie moléculaire sur du matériel fixé au formol de longue date).
Types de Fixateurs
Les fixateurs aldéhydiques — le formol neutre tamponné (FNBT) est le fixateur universel pour l’histopathologie de routine. Le glutaraldéhyde, avec ses deux groupes aldéhyde, réticule plus fortement et préserve mieux les ultrastructures pour la microscopie électronique. Le formol-zinc (solution de formol avec du sulfate de zinc) offre une meilleure préservation antigénique tout en restant un aldéhyde.
Les fixateurs alcooliques (éthanol, méthanol, alcool acétique de Carnoy, solution de Clarke) — précipitent les protéines sans réticulation majeure. Ils pénètrent rapidement et préservent les acides nucléiques pour la PCR et la biologie moléculaire, mais peuvent rétrécir excessivement le tissu. Le fixateur de Carnoy (éthanol, chloroforme, acide acétique) est excellent pour la fixation de l’ADN et est utilisé pour les biopsies ne nécessitant pas de classification morphologique détaillée.
Les fixateurs métalliques — les sels de mercure (formol de B-5, formol de Zenker) et les sels de chrome fournissent une excellente préservation morphologique pour les coupes minces (biopsies de moelle osseuse, ganglions lymphatiques). Toxiques et nécessitant une élimination spéciale.
Autres — le tétroxyde d’osmium (fixateur pour la microscopie électronique, préserve les lipides), l’acide picrique (Bouin, bon pour les biopsies gastro-intestinales et testiculaires), l’acétone (utilisée pour la fixation enzymatique en histochimie).
Problèmes Courants de Fixation
Sous-fixation — autolyse et artefact. Le tissu non fixé se dégrade rapidement ; l’autolyse progresse du centre vers la surface, donnant des noyaux pâles, flous, avec un cytoplasme gonflé et une perte des détails architecturaux. La sous-fixation est irréversible. Prévenir en coupant les spécimens à ≤5 mm d’épaisseur, en utilisant un rapport fixateur:tissu d’au moins 10:1 et en fixant pendant 24 à 48 heures.
Sur-fixation — durcissement excessif, coloration pâle et réticulation excessive des antigènes. Un séjour de plusieurs semaines dans le formol provoque une fixation excessive. Les acides nucléiques sont dégradés par des ponts méthylène excessifs. La récupération antigénique prolongée et les étapes de démasquage des protéinases en IHC peuvent atténuer partiellement la sur-fixation.
Précipité de formol — pigment cristallin brun foncé (pigment de formol, hématéine formolique) qui se dépose dans le tissu lorsque le formol non tamponné forme de l’acide formique et que le pH acide provoque la précipitation de l’hème. Le pigment de formol interfère avec la microscopie. Prévenir en utilisant du FNBT à pH 7,0 (tampon phosphate). Le pigment peut être retiré par traitement à l’ammoniac alcoolique ou à l’acide picrique saturé sur la coupe.
Brûlure par fixateur / nécrose à l’interface — les fixateurs caustiques ou déshydratants (alcool, Bouin, B-5, Zenker) brûlent la périphérie du spécimen qui entre en contact direct, créant un artéfact sombre et dur. Minimiser en réduisant le temps de fixation primaire et en rinçant rapidement.
