Après l’amplification par PCR ou la digestion par restriction, l’ADN doit être purifié pour éliminer les enzymes, amorces, nucléotides, sels et composants du tampon avant les applications en aval. Deux méthodes apparentées couvrent la plupart des besoins de purification.

Purification de PCR

La purification de PCR élimine les amorces, dNTP, polymérases et sels d’une réaction d’amplification. La plupart des kits commerciaux utilisent une membrane de silice dans une colonne de centrifugation : l’ADN se lie à la membrane en présence d’une concentration élevée de sels chaotropiques, les contaminants passent à travers, et l’ADN est élué dans un tampon à faible teneur en sel (généralement du Tris 10 mM ou de l’eau).

Le protocole typique : ajoutez le tampon de liaison (contenant du chlorhydrate de guanidine ou un chaotrope similaire) directement à la réaction PCR, chargez sur la colonne, centrifugez, lavez avec un tampon de lavage à base d’éthanol, centrifugez à nouveau, et éluez dans 20–50 µL. La récupération est typiquement de 60–90 %.

La purification de PCR est rapide (5–10 minutes) et fonctionne pour les fragments >100 pb. Elle n’élimine pas les dimères d’amorces ou les produits non spécifiques de taille similaire — seulement les amorces en excès et les petits fragments qui passent à travers la colonne.

Extraction sur Gel

L’extraction sur gel isole une bande d’ADN spécifique d’un gel d’agarose, éliminant tous les autres fragments d’ADN, y compris les dimères d’amorces et les produits de mauvais appariement. La bande désirée est excisée sous lumière UV à l’aide d’un scalpel propre, et l’agarose est dissous dans une solution de sel chaotropique à 50–60 °C. L’agarose fondu est ensuite passé à travers une colonne de silice comme dans la purification de PCR.

Considérations clés :

• Minimisez le temps d’exposition aux UV pour éviter les dommages à l’ADN (utilisez des UV à 365 nm au lieu de 302 nm si disponible).
• Coupez aussi près que possible de la bande pour minimiser le volume d’agarose.
• L’étape de dissolution nécessite suffisamment de tampon — généralement 3 volumes par volume de gel.
• Le rendement diminue pour les fragments >10 kb ; l’incubation du gel dissous à température ambiante au lieu de sur colonne améliore la récupération des grands fragments.

Purification de l’ADN par Précipitation

La précipitation à l’éthanol est une alternative traditionnelle qui ne nécessite pas de kits. Ajoutez 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol 100 % froid, incubez à −20 °C ou −80 °C, centrifugez à vitesse maximale pendant 15–30 minutes, lavez avec de l’éthanol 70 %, séchez à l’air et resuspendez. Cette méthode fonctionne pour toute taille de fragment mais prend plus de temps et n’élimine pas les dNTP aussi efficacement que les colonnes de silice.

Contrôle Qualité

Après purification, mesurez le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ pour vérifier la pureté (idéalement 1,8–2,0). Faites migrer un aliquot sur gel pour vérifier que la bande est intacte et de la bonne taille. Pour le clonage, le tampon d’élution doit être compatible avec les enzymes en aval — éluez dans de l’eau ou du Tris 10 mM (pas d’EDTA si une ligation suit).