Le pull-down GST-tag utilise des protéines de fusion glutathion S-transférase (GST) immobilisées sur agarose-glutathion pour purifier des protéines recombinantes à partir de systèmes d’expression ou pour capturer et identifier des interactions protéine-protéine à partir de lysats cellulaires.
Principe
La protéine GST de 26 kDa de Schistosoma japonicum est fusionnée à la protéine cible. La GST se lie au glutathion (GSH, γ-glutamyl-cystéinyl-glycine) immobilisé sur des billes d’agarose avec une haute affinité (K_d ≈ 0,1 µM). La protéine de fusion est capturée à partir de lysats bruts, lavée abondamment, et éluée avec 10–20 mM de glutathion réduit dans des conditions non dénaturantes. Pour les études d’interaction, la protéine de fusion GST immobilisée sert d’appât pour capturer les protéines interactrices d’un lysat, qui sont ensuite identifiées par Western blot ou spectrométrie de masse.
Résines de Glutathion
L’agarose-glutathion est typiquement constituée de billes d’agarose réticulée avec du glutathion couplé via l’atome de soufre. La capacité de liaison est de 5–15 mg de protéine de fusion GST par mL de résine. Le glutathion réduit est utilisé comme éluant compétitif. Un pré-gonflement et une équilibration dans du PBS ou un tampon similaire (pH 7,3–8,0) sont nécessaires avant utilisation. Les billes magnétiques de glutathion permettent des pull-downs rapides dans des tubes de microcentrifugeuse pour les études d’interaction à petite échelle.
Expression et Lyse
Les protéines de fusion GST sont exprimées dans des souches E. coli BL21(DE3) à partir de vecteurs pGEX (GE Healthcare), qui incluent un promoteur tac inductible par l’IPTG. L’expression à 18–25 °C pendant une nuit améliore la solubilité des cibles difficiles. La lyse dans du PBS (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 1,8 mM, pH 7,3) avec 1 % Triton X-100 ou 0,1 % Tween-20 réduit la liaison non spécifique. Le DTT (1–5 mM) maintient la GST sous sa forme active réduite. Les inhibiteurs de protéase et la DNase/RNase améliorent la qualité du lysat.
Protocole de Purification
Équilibrer l’agarose-glutathion avec du PBS. Incuber le lysat clarifié avec la résine (batch : 30–60 min, 4 °C ; colonne : gravité). Laver avec 20 volumes de PBS plus 0,1 % Triton X-100. Éluer avec 10 mM de glutathion réduit dans 50 mM Tris-HCl pH 8,0. Collecter des fractions de 0,5 mL. Dialyser la protéine éluée pour éliminer le glutathion pour les applications en aval. Supprimer l’étiquette GST par clivage à la thrombine ou à la protéase PreScission au niveau d’un site de reconnaissance conçu, suivi d’une étape soustractive sur agarose-glutathion pour capturer la GST libre et la fusion non clivée.
Protocole de Pull-Down pour Interactions
Immobiliser 50–200 µg d’appât de fusion GST sur 25–50 µL d’agarose-glutathion. Incuber avec le lysat cellulaire (0,5–2 mg de protéines totales) dans un tampon de liaison (PBS + 0,1 % NP-40) pendant 1–2 heures à 4 °C avec rotation. Laver 3–5 fois avec le tampon de liaison. Éluer avec 2× tampon d’échantillon SDS et analyser par SDS-PAGE suivi d’une coloration au Coomassie ou d’un Western blot. Inclure des billes GST seules comme contrôle négatif pour identifier les protéines se liant non spécifiquement à la GST ou à la résine. Une pré-incubation avec du glutathion compétiteur (10 mM) démontre une compétition spécifique.
Avantages et Limitations
L’étiquette GST améliore souvent l’expression et la solubilité de son partenaire de fusion, ce qui la rend précieuse pour les protéines difficiles. L’élution par le glutathion est douce et préserve l’activité protéique. La grande taille (26 kDa) peut cependant interférer avec certains tests fonctionnels, rendant le retrait de l’étiquette obligatoire. La dimérisation de la GST peut provoquer une oligomérisation indésirable des protéines de fusion. L’étiquette est idéale pour les études d’interaction par capture par affinité mais moins adaptée si l’ajout de 26 kDa au poids moléculaire est problématique pour le travail structural.
