La chromatographie d’affinité sur métal immobilisé purifie les protéines recombinantes à étiquette polyhistidine en se liant à des ions de métaux de transition immobilisés (Ni²⁺ ou Co²⁺) via les cycles imidazole des chaînes latérales de l’histidine et en éluant avec de l’imidazole ou à bas pH.
Principe
Une étiquette polyhistidine — typiquement 6 à 10 résidus histidine consécutifs — est fusionnée à l’extrémité N- ou C-terminale de la protéine recombinante. Le cycle imidazole de l’histidine se coordonne avec des ions métalliques divalents chélatés (Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺) immobilisés sur un support chromatographique via des chélateurs d’acide nitrilotriacétique ou d’acide iminodiacétique. Le Ni-NTA (acide nitrilotriacétique) fournit quatre sites de coordination à l’ion Ni²⁺, laissant deux sites disponibles pour la liaison de l’histidine. L’interaction est réversible : l’imidazole (20–500 mM) déplace compétitivement l’étiquette histidine, ou un pH bas (4,5–5,5) protone les chaînes latérales de l’histidine, perturbant la coordination métallique.
Types de Résine
Ni-NTA agarose (Qiagen, Thermo Fisher) est la résine IMAC la plus utilisée. La capacité de liaison est typiquement de 5–10 mg de protéine à étiquette 6×His par mL de résine sédimentée. Ni-Sepharose (GE Healthcare) offre des débits plus élevés pour les applications FPLC. TALON (Clontech/TaKaRa) utilise une résine Co²⁺-carboxyméthylaspartate, offrant une spécificité plus élevée avec une liaison non spécifique plus faible que le Ni-NTA, au prix d’une capacité inférieure. Les billes magnétiques (Dynabeads His-Tag, MagnaHis) permettent une purification en batch à partir de petits volumes. Des résines à haute capacité (jusqu’à 40 mg/mL) sont disponibles pour la purification préparative.
Tampons
Tampon de lyse/chargement : 20–50 mM Tris ou phosphate pH 7,5–8,0, 300–500 mM NaCl (supprime les interactions ioniques), 10–20 mM imidazole (réduit la liaison non spécifique). Tampon de lavage : même composition avec 20–40 mM imidazole. Tampon d’élution : 200–500 mM imidazole ou gradient de pH jusqu’à 4,5. La concentration en NaCl est critique — un sel plus faible augmente la liaison non spécifique des protéines acides. Des additifs tels que 1 mM DTT ou TCEP préviennent l’oxydation des cystéines de surface. Pour les protéines membranaires, des détergents compatibles avec l’IMAC (DDM, CHAPs, digitonine) à 0,1–1 % peuvent être inclus.
Protocole
Lyser les cellules dans un tampon de lyse avec inhibiteurs de protéase. Clarifier par centrifugation (20 000 g, 30 min) et filtration (0,45 µm). Équilibrer la résine avec 5 volumes de tampon de lyse. Incuber le lysat clarifié avec la résine (mode batch : 30 min en rotation à 4 °C, ou mode colonne : chargement à 0,5–1 mL/min). Laver avec 10–20 volumes de colonne de tampon de lavage jusqu’à stabilisation de la ligne de base UV. Éluer avec 5–10 volumes de tampon d’élution, en collectant des fractions. Analyser les fractions par SDS-PAGE et Western blot ou test Bradford.
Placement et Clivage de l’Étiquette
L’étiquette 6×His peut être placée à l’une ou l’autre extrémité. Les étiquettes N-terminales sont plus courantes et produisent une expression plus élevée dans E. coli, mais les étiquettes C-terminales réduisent le risque d’affecter les séquences signal N-terminales. L’étiquette peut être supprimée en incorporant un site de clivage par la protéase TEV, la thrombine ou le facteur Xa entre l’étiquette et la protéine. Le clivage est effectué après élution, suivi d’une étape IMAC soustractive pour éliminer l’étiquette clivée et la protéine non clivée.
Applications
La purification His-tag/IMAC est la méthode de purification de protéines la plus utilisée en biologie moléculaire. Elle fonctionne pour les protéines solubles exprimées dans E. coli, la levure, les cellules d’insecte et les cellules de mammifère. Elle purifie également les protéines membranaires solubilisées dans des détergents, les protéines de corps d’inclusion purifiées dans des conditions dénaturantes (urée 8 M ou chlorhydrate de guanidine 6 M), et les complexes protéiques via le marquage séquentiel de partenaires d’interaction (co-IMAC). La petite taille de l’étiquette interfère rarement avec la fonction protéique, ce qui la rend idéale pour la capture par affinité, les études structurales et les tests enzymatiques.
