Les méthodes d’amplification isotherme amplifient les acides nucléiques à température constante, éliminant le besoin d’un thermocycleur. Elles sont de plus en plus utilisées dans les diagnostics au point de soins, les tests sur le terrain et les environnements aux ressources limitées.

Présentation du LAMP

L’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) utilise 4–6 amorces qui reconnaissent 6–8 régions distinctes sur la séquence cible. La réaction est effectuée à 60–65 °C en utilisant une ADN polymérase avec activité de déplacement de brin (polymérase Bst de Bacillus stearothermophilus). La polymérase déplace continuellement les brins nouvellement synthétisés, créant des structures en boucle qui servent de matrices pour une amplification ultérieure.

Le résultat est une amplification exponentielle qui produit jusqu’à 10⁹ copies en moins d’une heure. En raison de l’ensemble complexe d’amorces et des produits d’amplification ramifiés, le LAMP est extrêmement spécifique — il peut discriminer des différences d’un seul nucléotide.

Conception des Amorces LAMP

Un ensemble d’amorces LAMP comprend :

• FIP (Forward Inner Primer) : contient les séquences F2 et F1c
• BIP (Backward Inner Primer) : contient les séquences B2 et B1c
• F3 et B3 (amorces externes) : initient le déplacement de brin
• Amorces de boucle optionnelles (LF et LB) : accélèrent la réaction en amorçant les structures en boucle

La conception des amorces est critique et se fait généralement avec un logiciel dédié (PrimerExplorer, LAMP Designer). La région cible doit être de 200–300 pb.

Méthodes de Détection

Les produits LAMP peuvent être détectés par :

• Turbidité : la grande quantité de précipité de pyrophosphate de magnésium formé pendant l’amplification est visible à l’œil nu.
• Colorants colorimétriques : le rouge de phénol ou le bleu d’hydroxynaphtol changent de couleur lorsque le pH de la réaction change ou que le magnésium est consommé.
• Fluorescence : les colorants intercalants (SYBR Green, EvaGreen) ou la calcéine produisent un signal fluorescent.
• Flux latéral : utilisant des amorces marquées qui incorporent des haptènes pour la détection sur bandelette immunochromatographique.

Autres Méthodes Isothermes

• RPA (Recombinase Polymerase Amplification) : utilise une recombinase pour apparier les amorces avec l’ADN duplex homologue, une protéine de liaison à l’ADN simple brin pour stabiliser le brin déplacé, et une polymérase à déplacement de brin. Elle fonctionne à 37–42 °C et produit un produit détectable en 5–20 minutes. La RPA est la méthode isotherme la plus rapide et est compatible avec des formats lyophilisés.
• HDA (Helicase-Dependent Amplification) : utilise une hélicase à ADN pour dérouler la double hélice au lieu de la dénaturation par la chaleur, fonctionnant à 37–65 °C selon l’hélicase.
• NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) : amplifie les cibles d’ARN à 41 °C en utilisant trois enzymes (transcriptase inverse, RNase H et ARN polymérase T7), produisant des amplicons d’ARN.

Applications

L’amplification isotherme est largement utilisée pour la détection d’agents pathogènes (SARS-CoV-2, paludisme, tuberculose, virus Zika), les tests de sécurité alimentaire et la surveillance environnementale. La capacité d’effectuer des réactions dans un bain-marie ou un bloc chauffant et de détecter les résultats par changement de couleur la rend idéale pour les tests décentralisés.