Le séquençage de nouvelle génération (NGS) englobe un ensemble de technologies de séquençage modernes capables de séquencer des millions de fragments d’ADN en parallèle, permettant ainsi de séquencer des génomes entiers rapidement et à moindre coût. Des plateformes telles que Illumina, Ion Torrent et PacBio dominent le domaine.
Comment fonctionne NGS (plateforme Illumina)
- Préparation de la bibliothèque
L’ADN est fragmenté en petits morceaux, généralement de 200 à 600 paires de bases. Les adaptateurs (courtes séquences connues) sont ligaturés aux deux extrémités de chaque fragment. Ces adaptateurs permettent aux fragments de se lier à la Flow Cell et servent de sites d’amorçage pour le séquençage.
- Génération de clusters
La bibliothèque est chargée sur une Flow Cell dont la surface est recouverte d’oligonucléotides complémentaires. Chaque fragment se lie à la Flow Cell et subit une amplification en pont : le fragment se plie, un nouveau brin est synthétisé et le processus se répète, créant un groupe de milliers de copies identiques de chaque fragment.
- Séquençage par synthèse
Les nucléotides marqués par fluorescence circulent un par un sur la Flow Cell. Chaque nucléotide possède un terminateur réversible qui permet d’ajouter une seule base par cycle. Après chaque cycle, la fluorescence est imagée pour identifier quelle base a été ajoutée à chaque cluster.
- Analyse des données
Des millions de lectures de séquençage sont générées. Ces lectures sont alignées sur un génome de référence ou assemblées de novo. Les outils bioinformatiques identifient les variantes génétiques, les niveaux d’expression des gènes ou les modifications épigénétiques en fonction de l’application.
- Candidatures
NGS est utilisé pour le séquençage du génome entier, les panels de gènes ciblés, le séquençage d’ARN, l’analyse épigénétique et la métagénomique, entre autres applications.
Flux de travail pratique de préparation de la bibliothèque NGS
Commencez avec 10 à 100 ng d’ADN génomique de haute qualité (A260/A280 > 1,8, A260/A230 > 2,0). Fragmentez l’ADN à l’aide d’un sonicateur Covaris ou d’une fragmentation enzymatique pour atteindre une taille cible de 200 à 600 pb. Effectuer une réparation d’extrémité pour générer des extrémités émoussées, suivie d’un A-tailing (ajout d’une seule adénosine aux extrémités 3’) à l’aide du fragment de Klenow. Ligate Illumina-compatible adaptateurs contenant un surplomb de 5’ T aux fragments à queue A à l’aide de l’ADN ligase T4. Purifiez les produits de ligature à l’aide de billes AMPure XP à un rapport perle/échantillon de 0,8 × pour éliminer les adaptateurs non ligaturés. Amplifiez la bibliothèque ligaturée par adaptateur par PCR pendant 8 à 12 cycles en utilisant des amorces complémentaires aux séquences adaptatrices ; inclure des codes-barres uniques à double index pour le multiplexage des échantillons. Nettoyez le produit PCR avec des billes AMPure XP au rapport 0,8×. Évaluez la qualité et la quantité de la bibliothèque à l’aide d’un bioanalyseur ou d’une TapeStation (distribution de taille attendue : 250 à 700 pb) et de la quantification fluorométrique Qubit. Normalisez les bibliothèques à 4 nM, regroupez-les de manière équimolaire et dénaturez-les avec du NaOH 0,2 N avant de les charger sur la Flow Cell Illumina à 1,8 pM pour un séquençage à extrémités appariées de 2 × 150 pb. Surveillez la densité des clusters (cible : 800 à 1 200 K/mm² pour HiSeq 4000) et les scores Q30 (>80 % pour les analyses de haute qualité). Démultiplexez la sortie à l’aide de bcl2fastq et évaluez la qualité par base avec FastQC. Coupez les adaptateurs et les bases de mauvaise qualité à l’aide de Trimmomatic avant l’alignement.
Application du monde réel
En génomique clinique du cancer, un panel NGS ciblé couvrant 500 gènes liés au cancer est utilisé pour profiler la biopsie tumorale d’un patient. La préparation de bibliothèques à partir de 50 ng d’ADN FFPE donne 94 % des cibles couvertes à une profondeur >100×. L’analyse identifie une mutation KRAS G12C (0,46 VAF) et une amplification de l’EGFR, guidant la sélection du traitement avec un inhibiteur de MEK.
