La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) a engendré de nombreuses variantes et applications spécialisées qui étendent son utilité au-delà de la simple amplification d’ADN. Ces techniques permettent la détection de mutations, l’analyse de la méthylation, le diagnostic moléculaire et l’identification médico-légale.

PCR Allèle-Spécifique

La PCR allèle-spécifique discrimine entre des séquences d’ADN différant par un seul nucléotide. La méthode utilise des amorces dont la base terminale 3’ est positionnée au site polymorphe. Lorsque la base terminale correspond à la matrice, l’amplification se déroule efficacement. En cas de mésappariement, l’extension est bloquée ou fortement réduite. En utilisant deux amorces spécifiques pour chaque allèle dans des réactions séparées, le génotype peut être déterminé. La technique est largement utilisée pour le génotypage des polymorphismes mononucléotidiques et la détection de mutations associées à des maladies telles que le facteur V Leiden et la prothrombine G20210A.

PCR Spécifique de la Méthylation

La PCR spécifique de la méthylation détecte les profils de méthylation de l’ADN, qui sont des marques épigénétiques importantes dans le cancer et le développement. L’ADN génomique est traité au bisulfite de sodium, qui convertit les cytosines non méthylées en uracile tout en laissant les cytosines méthylées inchangées. La PCR avec des amorces conçues pour distinguer les séquences converties et non converties détermine ensuite le statut de méthylation des sites CpG. La technique est utilisée pour détecter la méthylation aberrante des promoteurs dans les gènes suppresseurs de tumeurs et pour l’analyse de l’empreinte génomique.

PCR Inverse

La PCR inverse amplifie les régions d’ADN flanquant une séquence connue, utile pour identifier les sites d’insertion ou caractériser les régions flanquantes inconnues. L’ADN génomique est digéré par une enzyme de restriction qui coupe en dehors de la région connue, et les fragments sont circularisés par ligature. La PCR avec des amorces orientées vers l’extérieur à partir de la séquence connue amplifie ensuite l’ADN flanquant inconnu à travers la jonction de ligature. La PCR inverse a été utilisée pour caractériser les sites d’insertion de transposons et les sites d’intégration viraux dans le génome.

PCR Dégénérée

La PCR dégénérée utilise des mélanges d’amorces contenant des bases mixtes à des positions spécifiques pour amplifier des gènes apparentés de différentes espèces ou des membres d’une famille de gènes. Les amorces sont conçues à partir de séquences d’acides aminés conservées, avec une dégénérescence introduite aux positions de wobble des codons. La technique est utilisée pour cloner des gènes homologues à partir de nouvelles espèces, identifier les membres d’une famille de gènes et détecter les pathogènes à séquences variables. La PCR touchdown, où la température d’hybridation est progressivement diminuée, améliore la spécificité de la PCR dégénérée.

Applications de la PCR Quantitative

La PCR quantitative (qPCR) va au-delà de la mesure de l’expression génique. L’analyse du nombre de copies utilise la qPCR pour détecter les délétions ou amplifications de gènes en comparant l’amplification d’un gène cible à un gène de référence. La technique est utilisée dans le test HER2 pour le cancer du sein et pour détecter les anomalies chromosomiques. La détection des pathogènes utilise la qPCR pour quantifier la charge virale chez les patients atteints du VIH, de l’hépatite B et de l’hépatite C, guidant les décisions thérapeutiques. La détection des OGM quantifie la quantité de matériel génétiquement modifié dans les produits alimentaires.

Applications de la PCR Digitale

La PCR digitale fournit une quantification absolue sans courbes standard. Elle est utilisée pour détecter les mutations rares dans l’ADN tumoral circulant, permettant la biopsie liquide pour le suivi du cancer. La PCR digitale détecte également la maladie résiduelle après traitement, identifie les aneuploïdies fœtales à partir du sang maternel et caractérise les variations du nombre de copies avec une haute précision. La haute sensibilité de la PCR digitale permet la détection d’allèles mutants présents à des fréquences inférieures à 0,1 %.

PCR Médico-Légale

L’analyse des répétitions courtes en tandem par PCR multiplex est la méthode standard d’identification humaine en criminalistique. Les kits commerciaux amplifient 15 à 20 locus STR plus le marqueur de détermination du sexe amelogénine en une seule réaction. Les fragments amplifiés sont séparés par électrophorèse capillaire, et les tailles d’allèles sont déterminées. La probabilité que deux individus non apparentés partagent le même profil STR est typiquement inférieure à un sur un milliard. L’analyse de l’ADN de contact permet le profilage à partir d’échantillons minuscules ne contenant que quelques cellules.

PCR sur Cellule Unique

La PCR sur cellule unique amplifie le génome ou le transcriptome de cellules individuelles, révélant une hétérogénéité qui est masquée dans l’analyse en masse. La technique commence par l’isolement cellulaire par micromanipulation, tri cellulaire ou microfluidique. L’amplification du génome entier par amplification par déplacement multiple ou par des méthodes basées sur la PCR augmente la quantité d’ADN pour les analyses en aval. Le séquençage d’ARN sur cellule unique utilise la transcription inverse et l’amplification par PCR pour profiler l’expression génique dans des cellules individuelles, révélant les types cellulaires, les états et les trajectoires de développement.