La titration virale est essentielle pour quantifier les virus infectieux dans la recherche, la production de vaccins et le diagnostic clinique. Le dosage des plaques est l’étalon-or pour mesurer le titre viral infectieux.

Principe du Dosage des Plaques

Lorsqu’un virus infecte une monocouche de cellules sensibles dans une boîte de culture, il se réplique et se propage aux cellules adjacentes. Après plusieurs cycles d’infection, une zone localisée de mort cellulaire (une plaque) devient visible. On suppose que chaque plaque provient d’une seule particule virale infectieuse.

Le processus :

1. Cultivez une monocouche confluente de cellules sensibles (par exemple, cellules Vero pour de nombreux virus) dans une plaque multi-puits.
2. Infectez la monocouche avec des dilutions en série de l’échantillon viral.
3. Laissez l’adsorption virale pendant 1–2 heures avec agitation périodique.
4. Recouvrez les cellules avec un milieu semi-solide (agarose, méthylcellulose ou carboxyméthylcellulose) qui empêche le virus de se propager dans le milieu liquide, limitant l’infection aux cellules adjacentes au site d’infection d’origine.
5. Incubez pendant 2–10 jours (selon le virus) jusqu’à ce que les plaques soient visibles.
6. Fixez et colorez la monocouche avec du violet cristal, du rouge neutre ou de la formaline. Les plaques apparaissent comme des zones claires sur un fond de cellules colorées.

Comptez les plaques et calculez : unités formant plaques par mL (UFP/mL) = (nombre de plaques) / (dilution × volume ensemencé en mL).

Dosage TCID₅₀

Le dosage TCID₅₀ (Dose Infectieuse 50 % en Culture Tissulaire) est une méthode de dilution limite qui ne nécessite pas de visualisation des plaques. Des dilutions en série du virus sont ajoutées à des puits répliqués d’une plaque 96 puits contenant des cellules sensibles. Après incubation, les puits sont évalués pour l’effet cytopathique (ECP). La TCID₅₀ est la dilution à laquelle 50 % des puits montrent un ECP, calculée par la méthode de Reed–Muench ou Spearman–Kärber.

Les valeurs TCID₅₀/mL peuvent être converties en UFP/mL (approximativement 1 UFP ≈ 0,7 unité TCID₅₀), mais la relation n’est pas exacte et dépend du virus et du type cellulaire.

Dosage par Foyers Fluorescents

Pour les virus qui ne produisent pas de plaques claires ou d’ECP, les protéines virales sont détectées par immunofluorescence. La monocouche infectée est fixée et colorée avec des anticorps fluorescents contre un antigène viral. Les foyers fluorescents sont comptés au microscope à épifluorescence, donnant des unités formant foyers par mL (UFF/mL).

Dosage d’Hémagglutination

Certains virus (grippe, paramyxovirus) ont des hémagglutinines qui lient et agglutinent les globules rouges. Des dilutions en série du virus sont mélangées avec des GR dans une plaque à fond en V. Le titre d’hémagglutination est la dilution la plus élevée qui provoque encore une agglutination (un réseau diffus de GR qui ne se dépose pas en bouton). Le dosage HA est rapide et peu coûteux mais mesure les particules virales totales, pas les particules infectieuses.