Aperçu
Le séquençage des petits ARN cible la classe de courtes molécules d’ARN non codantes – généralement de 18 à 35 nucléotides – qui jouent un rôle régulateur essentiel dans l’expression des gènes. Ceux-ci incluent les microARN (miARN), les petits ARN interférents (siARN) et les ARN interagissant avec Piwi (piARN). Malgré leur petite taille, ces molécules exercent un contrôle puissant sur la stabilité, la traduction, l’état de la chromatine et l’inactivation des transposons. Les petits séquençages d’ARN nécessitent une préparation de bibliothèque spécialisée pour capturer des fragments aussi courts et des outils bioinformatiques distincts pour une annotation et une quantification précises.
Méthodes
La préparation d’une petite bibliothèque d’ARN-seq implique une sélection de la taille de l’ARN (généralement par excision sur gel ou purification à base de billes), la ligature des adaptateurs 3’ et 5’, une transcription inverse et une amplification PCR. Étant donné que les petits ARN sont plus courts que la longueur de lecture, ils sont entièrement séquencés et les séquences adaptatrices doivent être coupées avec précision pendant le prétraitement. Des outils d’alignement dédiés (tels que miRDeep2, sRNAbench ou ShortStack) mappent les lectures vers de petites bases de données d’ARN connues (miRBase pour les miARN, Rfam pour les autres ARNnc). La quantification estime les niveaux d’expression des miARN connus tandis que la détection de nouveaux miARN repose sur des structures précurseurs caractéristiques en épingle à cheveux. L’analyse de l’expression différentielle suit des principes similaires à ceux de l’ARNm-seq, mais avec des considérations particulières pour la normalisation, car les petits ARN ont des distributions de longueur et des biais GC différents.
### Candidatures
Le profilage des petits ARN a révélé les rôles régulateurs omniprésents de ces molécules. Les signatures miARN distinguent les sous-types de cancer et prédisent la réponse au traitement. Les miARN circulant dans le sang ou le sérum servent de biomarqueurs mini-invasifs pour des maladies telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et la neurodégénérescence. L’analyse se connecte à des études plus larges sur la [structure et les types d’ARN] (/guides/rna-structure-and-types.html) et sur la [régulation des gènes et épigénétique] (/guides/gene-regulation-and-epigenetics.html), car de nombreux petits ARN participent à des boucles de régulation avec des facteurs de transcription et des modificateurs épigénétiques. Comprendre la biogenèse des petits ARN s’appuie également sur les concepts de transcription et traitement de l’ARN, en particulier le rôle de Drosha et Dicer dans la maturation des miARN.
Protocole pratique
La préparation d’une petite bibliothèque d’ARN-seq commence par l’apport total d’ARN (100 à 1 000 ng). La sélection de la taille est essentielle : les fragments d’ARN de 18 à 35 nt sont isolés par excision sur gel d’un gel de polyacrylamide à 15 % ou par purification à base de billes avec des billes AMPure XP à des concentrations spécifiques de PEG. La ligature de l’adaptateur utilise l’ARN ligase 2 T4 tronquée pour l’adaptateur 3’ (minimisant la circularisation) et l’ARN ligase 1 T4 pour l’adaptateur 5’. Après transcription inverse avec SuperScript III, l’ADNc est amplifié par PCR (12 à 15 cycles pour éviter une suramplification) et à nouveau sélectionné en taille pour éliminer les dimères adaptateurs. Pour le prétraitement, Cutadapt coupe précisément les séquences d’adaptateur : cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG --discard-untrimmed -m 18 -M 35 -o trimmed.fastq raw.fastq. L’indicateur --discard-untrimmed supprime les lectures sans adaptateur détectable. Pour la découverte et la quantification des miARN, « miRDeep2 » fournit un pipeline complet : exécutez « mapper.pl » pour traiter les lectures, « miRDeep2.pl » pour identifier les miARN connus et nouveaux par rapport à miRBase, et « quantifier.pl » pour quantifier l’expression. Le pipeline évalue les précurseurs de miARN candidats en évaluant la structure caractéristique en épingle à cheveux : un score miRDeep2 supérieur à 10 indique des prédictions de haute confiance. Les outils alternatifs incluent « sRNAbench » pour les espèces avec des annotations miRBase incomplètes et « ShortStack » pour la découverte de novo de petits ARN sans génome de référence. La normalisation des petites données d’expression d’ARN nécessite une attention particulière ; les options incluent le TPM (transcriptions par million), les lectures par million (RPM) ou l’utilisation de contrôles de pointe tels que le cel-miR-39 synthétique. L’analyse d’expression différentielle peut être effectuée avec « DESeq2 » sur les données de comptage, mais l’estimation du facteur de taille doit utiliser uniquement le nombre de miARN plutôt que les lectures cartographiées totales pour éviter les biais dus à de petits ARN non-miARN abondants.
