L’électrophorèse sur gel d’agarose est une technique de laboratoire fondamentale utilisée pour séparer les fragments d’ADN en fonction de leur taille. Lorsque les scientifiques doivent analyser l’ADN après digestion par restriction, PCR ou purification, ils se tournent vers l’électrophorèse sur gel pour visualiser les résultats. Alors que les gels d’agarose en plaques restent la norme pour l’analyse de routine de l’ADN, l’électrophorèse capillaire sur gel (CGE) offre une alternative automatisée à haut débit avec la détection par fluorescence induite par laser, largement utilisée dans le profilage médico-légal de l’ADN et le séquençage de l’ADN.
Comment fonctionne l’électrophorèse sur gel d’agarose
La technique repose sur le fait que l’ADN est chargé négativement et migre vers une électrode positive lorsqu’il est placé dans un champ électrique.
- Préparation du gel
La poudre d’agarose est mélangée avec un tampon TAE ou TBE (généralement 1 × TAE ou 0,5 × TBE) et chauffée jusqu’à dissolution. L’agarose fondu est versé dans un plateau de coulée avec un peigne inséré pour créer des puits. En refroidissant, il se solidifie en une matrice de gel poreuse.
- Chargement des échantillons
Les échantillons d’ADN sont mélangés avec un colorant de chargement contenant du glycérol (pour les faire couler) et des colorants de suivi (pour surveiller la migration). Les échantillons sont pipetés dans les puits du gel. Une échelle d’ADN – un mélange de fragments de tailles connues – est chargée dans le premier puits comme référence de taille.
- Électrophorèse
Un courant électrique est appliqué à travers le gel. Puisque l’ADN est chargé négativement, les fragments se déplacent à travers le gel vers l’électrode positive. Les fragments plus petits parcourent facilement les pores du gel et se déplacent rapidement, tandis que les fragments plus gros se déplacent plus lentement. Au fil du temps, les fragments se séparent en bandes distinctes en fonction de leur taille.
- Visualisation
Après électrophorèse, le gel est coloré avec un colorant liant l’ADN tel que le bromure d’éthidium ou SYBR Safe. Lorsqu’il est placé sous une lumière UV, le colorant devient fluorescent, révélant les bandes d’ADN. En comparant les positions des bandes à l’échelle de l’ADN, les scientifiques peuvent déterminer la taille de chaque fragment.
Protocole pratique d’électrophorèse sur gel
Sélectionnez le pourcentage d’agarose en fonction des tailles de fragments attendues : 0,7 % pour 0,8 à 10 kb, 1,0 % pour 0,5 à 5 kb, 1,5 % pour 0,2 à 3 kb et 2,0 % pour 0,1 à 1 kb. Peser la quantité appropriée d’agarose (par exemple, 1 g pour un gel à 1 %) et ajouter 100 ml de tampon 1 × TAE. Chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement – tourbillonner toutes les 30 secondes pour éviter la surchauffe. Refroidir à ~60°C, ajouter 5 µL de GelGreen ou de bromure d’éthidium (10 mg/mL), mélanger et verser dans un plateau de coulée avec le peigne inséré. Laisser solidifier pendant 20 à 30 minutes. Placer le gel dans la cuve d’électrophorèse remplie de 1× TAE. Mélanger 5 µL de chaque échantillon d’ADN avec 1 µL de colorant de chargement 6× (contenant du glycérol et du bleu de bromophénol). Chargez tout le volume dans un puits. Chargez 5 µL d’une échelle d’ADN Plus de 1 kb dans le premier et le dernier puits. Fonctionnez à 5-10 V/cm (mesuré comme la distance entre les électrodes) — pour un gel de 10 cm, 80-100 V est typique. Exécutez jusqu’à ce que le front du colorant bleu de bromophénol ait migré sur environ les deux tiers de la longueur du gel (30 à 60 minutes). Visualisez sur un transilluminateur UV (302 nm pour le bromure d’éthidium, 470 nm pour GelGreen) et photographiez. Pour les applications en aval (extraction sur gel), utilisez un UV à longue longueur d’onde (365 nm) pour minimiser les dommages à l’ADN.
Application du monde réel
Après PCR amplifiant un fragment de gène de 1,5 kb, 5 µL de produit sont passés sur un gel d’agarose à 1 % le long d’une échelle de 1 kb. Une bande unique brillante à 1,5 kb confirme une amplification réussie sans amorce-dimère ni produits non spécifiques. Le gel est photographié et la bande est excisée sous UV pour purification et clonage.
