La co-immunoprécipitation (Co-IP) est la méthode la plus utilisée pour détecter et identifier les interactions protéine–protéine dans des conditions natives. Elle utilise un anticorps spécifique pour capturer une protéine appât et toutes les protéines qui lui sont liées à partir d’un lysat cellulaire.

Principe

Un anticorps contre la protéine cible (appât) est immobilisé sur un support solide — généralement des billes d’agarose Protéine A/G ou des billes magnétiques. Lorsque les billes conjuguées à l’anticorps sont incubées avec un lysat cellulaire ou tissulaire, la protéine appât est capturée avec toutes les protéines qui lui sont physiquement associées. Après lavage pour éliminer le matériel non lié, les protéines liées sont éluées et analysées par Western blot ou spectrométrie de masse.

Aperçu du Protocole

1. Préparez le lysat en utilisant un tampon de lyse doux et non dénaturant qui préserve les interactions protéiques (par exemple, Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 1 %, inhibiteurs de protéases). Maintenez les échantillons sur glace.
2. Pré-clarifiez le lysat en incubant avec des billes vierges (sans anticorps) pour éliminer les protéines qui se lient non spécifiquement à la surface des billes.
3. Incubez le lysat pré-clarifié avec les billes conjuguées à l’anticorps à 4 °C pendant 1–4 heures (ou toute la nuit) avec rotation douce.
4. Lavez les billes 3–5 fois avec du tampon de lyse froid. La stringence peut être augmentée en élevant la concentration en sel (NaCl 250–500 mM) ou en ajoutant un détergent doux (Tween-20 0,1 %).
5. Éluez les protéines liées avec du tampon d’échantillon SDS-PAGE et chaleur (5 minutes à 95 °C).
6. Analysez par Western blot (pour les interacteurs connus) ou spectrométrie de masse (pour la découverte).

Contrôles

Des contrôles rigoureux sont essentiels :

• Contrôle isotypique : utilisez un anticorps non spécifique du même isotype pour distinguer la liaison spécifique du bruit de fond.
• Contrôle billes seules : billes sans anticorps pour identifier les protéines se liant à la matrice de billes.
• Contrôle knock-down/knock-out : lysat de cellules dépourvues de la protéine appât pour démontrer la spécificité de l’anticorps.
• Co-IP réciproque : effectuez l’IP réciproque en utilisant un anticorps contre l’interacteur suspecté.

Réticulation (Crosslinking)

Les anticorps eux-mêmes co-éluent avec la cible et peuvent interférer avec la spectrométrie de masse. La réticulation de l’anticorps aux billes (en utilisant DSS ou BS³) avant l’incubation empêche l’élution de l’anticorps. Un contrôle avec des billes réticulées doit confirmer que l’anticorps est toujours fonctionnel après la réticulation.

Variantes

• Co-IP native : utilise un tampon de lyse non dénaturant. Préserve les complexes natifs mais peut co-précipiter des protéines indirectement associées.
• Co-IP avec réticulation : un agent de réticulation réversible (par exemple, formaldéhyde, DSP) stabilise les interactions faibles ou transitoires avant la lyse.
• Co-IP nucléaire : pour les complexes de facteurs de transcription, utilisez un protocole d’extraction nucléaire et incluez de la DNase I pour libérer les protéines liées à la chromatine.