La quantification des protéines est le processus permettant de déterminer la concentration de protéines dans une solution. Une quantification précise des protéines est essentielle pour de nombreuses applications en aval, notamment SDS-PAGE, Western blot, essais enzymatiques et les études structurelles.
Méthodes courantes de quantification des protéines
Test de Bradford
Le test Bradford est basé sur la liaison du colorant Coomassie Brilliant Blue G-250 aux protéines. Le colorant passe du brun au bleu lorsqu’il est lié à une protéine, l’absorbance maximale passant de 465 nm à 595 nm. Le test est rapide, simple et compatible avec la plupart des tampons. C’est moins précis en présence de détergents.
Test BCA
Le dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) repose sur la réduction de Cu2+ en Cu1+ par des protéines en milieu alcalin. BCA chélate ensuite le Cu1+, formant une couleur violette qui absorbe à 562 nm. Le test BCA est plus tolérant aux détergents que le test Bradford mais est moins compatible avec les agents réducteurs.
Test de Lowry
Le test Lowry combine la réaction du biuret (chélation du cuivre) avec le réactif Folin-Ciocalteu, qui réagit avec les résidus de tyrosine et de tryptophane. Il produit une couleur bleue mesurée à 750 nm. Il est sensible mais nécessite un timing minutieux et est affecté par de nombreuses substances interférentes.
Absorbance UV (A280)
Les protéines absorbent la lumière UV à 280 nm en raison des résidus de tryptophane et de tyrosine. L’absorbance à 280 nm fournit une estimation rapide et non destructive de la concentration en protéines. Elle est plus précise pour les protéines pures dont les coefficients d’extinction sont connus.
Courbe standard
Tous les tests colorimétriques nécessitent une courbe étalon. Des dilutions en série d’un étalon protéique connu, généralement de l’albumine sérique bovine (BSA), sont préparées et mesurées. L’absorbance de l’échantillon inconnu est comparée à la courbe standard pour calculer sa concentration.
Protocoles pratiques de test BCA et Bradford
Test BCA : Préparez les étalons BSA par dilution en série dans le même tampon que les échantillons — une plage typique est de 25 à 2 000 µg/mL (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1 000, 1 500, 2 000 µg/mL). Mélanger 25 µL de chaque standard ou échantillon avec 200 µL de réactif de travail BCA (rapport 50:1 du réactif A au réactif B) dans une plaque à 96 puits. Incuber à 37°C pendant 30 minutes. Refroidir à température ambiante et mesurer l’absorbance à 562 nm. Ajuster une courbe standard quadratique ou linéaire. Le test BCA est compatible avec les détergents (SDS, Triton X-100) jusqu’à 5% mais est incompatible avec les agents réducteurs (DTT, β-mercaptoéthanol) > 1 mM. Test Bradford : Préparez des étalons dans la même plage (25 à 1 000 µg/mL). Mélanger 10 µL d’étalon ou d’échantillon avec 200 µL de réactif Bradford (colorant Coomassie G-250 dans de l’acide phosphorique et du méthanol). Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Mesurer l’absorbance à 595 nm. Le test Bradford est rapide (2 minutes) et compatible avec les agents réducteurs et chélateurs (EDTA) mais est fortement inhibé par les détergents (>0,1% Triton X-100 ou SDS). Pour les deux tests, incluez des blancs contenant uniquement du tampon. Chaque étalon et chaque échantillon doivent être analysés en double ou en triple. Jeter les lectures avec un CV > 15 %. Résolvez les problèmes de bruit de fond élevé en diluant davantage l’échantillon, en changeant de test (utilisez Bradford si les échantillons contiennent des agents réducteurs, utilisez du BCA si les échantillons contiennent des détergents) ou en effectuant une précipitation au TCA/acétone pour éliminer les substances interférentes.
Application du monde réel
Lors de la quantification du lysat protéique de cellules de mammifères extraites dans un tampon RIPA (contenant 1 % de Triton X-100 et 0,1 % de SDS), le test BCA est préféré à celui de Bradford. La courbe standard de 25 à 2 000 µg/mL de BSA dans le tampon RIPA montre R² = 0,996. Le lysat inconnu donne A562 = 0,45, correspondant à 1250 µg/mL. Après dilution, 20 µg sont chargés par piste pour SDS-PAGE ou pour analyse par électrophorèse sur gel capillaire.
