La PCR numérique (dPCR) est un raffinement de la PCR conventionnelle qui permet une quantification absolue des acides nucléiques sans avoir besoin d’une courbe standard. L’échantillon est divisé en milliers de minuscules réactions individuelles et, après amplification, le nombre de partitions positives par rapport aux partitions négatives est compté.
Comment fonctionne la PCR numérique
- Partitionnement
Le mélange PCR contenant l’échantillon, les amorces, la sonde et la polymérase est divisé en milliers de partitions de la taille d’un nanolitre. Cela peut être fait à l’aide d’une puce avec des micropuits, de gouttelettes dans une émulsion d’huile (PCR numérique en gouttelettes) ou d’autres méthodes. Chaque partition contient soit zéro, soit au moins une copie de l’ADN cible.
- Amplification
L’échantillon divisé subit un cycle thermique standard. Dans chaque partition, la PCR se déroule indépendamment. Les partitions contenant l’ADN cible produisent un produit amplifié, tandis que les partitions vides n’en produisent aucun.
- Détection du point final
Après amplification, chaque partition est analysée pour la fluorescence. Les partitions contenant de l’ADN cible amplifié sont considérées comme positives (fluorescentes), tandis que celles qui n’en contiennent pas sont considérées comme négatives. Aucun cycle de quantification (Ct) n’est nécessaire : il s’agit simplement d’une lecture oui ou non par partition.
- Statistiques de Poisson
Le partitionnement étant aléatoire, certaines partitions peuvent contenir plusieurs copies de la cible. Les statistiques de Poisson sont utilisées pour calculer le nombre absolu de molécules cibles dans l’échantillon d’origine en fonction de la proportion de partitions négatives.
- Candidatures
La PCR numérique est très précise et est utilisée pour quantifier les mutations rares, détecter les agents pathogènes en faible abondance, analyser les variations du nombre de copies et vérifier les résultats NGS. Il est moins sensible aux inhibiteurs de la PCR que qPCR et fournit une quantification absolue sans normes.
Flux de travail pratique dPCR
Préparez le master mix PCR contenant l’échantillon d’ADN (1 à 100 ng), les amorces, la sonde et l’huile de génération de gouttelettes. Pour la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), chargez le mélange dans un générateur de gouttelettes qui divise l’échantillon en ~ 20 000 gouttelettes uniformes de nanolitres dans une émulsion eau dans huile. Pour la dPCR sur puce, l’échantillon est chargé dans une puce microfluidique avec des micropuits préfabriqués (généralement environ 20 000 puits). Transférer l’échantillon partitionné vers un thermocycleur et amplifier jusqu’au point final en utilisant des conditions de cyclage standard. Après amplification, lire la fluorescence de chaque partition à l’aide d’un lecteur dédié. Les partitions avec l’ADN cible présentent une fluorescence supérieure à un seuil défini manuellement et sont considérées comme positives. Appliquer les statistiques de Poisson : λ = −ln(1 − p) où p est la fraction des partitions positives ; la concentration cible absolue (copies/µL) est λ divisée par le volume de partition. Utilisez au moins 10 000 partitions acceptées pour une quantification fiable. Incluez un contrôle sans modèle et un contrôle positif avec un numéro de copie connu. Pour la détection de mutations rares, utilisez des sondes fluorescentes doubles – une sonde de type sauvage marquée avec FAM et une sonde mutante avec HEX – pour distinguer les molécules mutantes des molécules de type sauvage dans la même réaction.
Application du monde réel
Dans la biopsie liquide pour la surveillance du cancer, la ddPCR détecte les mutations de l’ADN tumoral circulant (ADNc) telles que l’EGFR T790M dans le cancer du poumon non à petites cellules. L’ADN plasmatique (10 ng) est extrait du sang et analysé avec des sondes spécifiques aux mutations. La ddPCR résout les fréquences des allèles mutants aussi basses que 0,01 %, bien en dessous de la limite de détection du séquençage de Sanger. Le nombre absolu de copies de molécules mutantes par ml de plasma est calculé, permettant un suivi longitudinal de la charge tumorale et une détection précoce de la résistance au traitement.
