Le séquençage de Sanger, également connu sous le nom de séquençage de terminaison de chaîne, est une méthode utilisée pour déterminer l’ordre exact des nucléotides dans une molécule d’ADN. Développé par Frederick Sanger en 1977, il reste la référence en matière de validation des séquences d’ADN et de détection des mutations.
Comment fonctionne le séquençage de Sanger
- Configuration de la réaction
L’ADN à séquencer est mélangé avec une amorce d’ADN, de l’ADN polymérase, des nucléotides normaux (dNTP) et une petite quantité de didésoxynucléotides marqués par fluorescence (ddNTP). Chacun des quatre ddNTP est marqué avec un colorant fluorescent différent.
- Terminaison de la chaîne
La réaction commence par la liaison de l’amorce à l’ADN matrice. L’ADN polymérase étend l’amorce en ajoutant des dNTP. Chaque fois qu’un ddNTP est incorporé à la place d’un dNTP, la chaîne cesse de croître car les ddNTP n’ont pas le groupe 3’-hydroxyle nécessaire à une extension ultérieure.
- Génération de fragments
Ce processus produit un mélange de fragments d’ADN de différentes longueurs, chacun se terminant à une position nucléotidique spécifique. Le marqueur fluorescent sur le ddNTP terminal identifie quelle base se trouve à la fin de chaque fragment.
- Électrophorèse capillaire
Le mélange est chargé dans un instrument électrophorèse capillaire, où la séparation basée sur la taille est effectuée par électrophorèse capillaire sur gel. Les fragments migrent à travers une matrice polymère dans le capillaire et sont détectés par fluorescence induite par laser lorsqu’ils franchissent la fenêtre de détection. Un laser excite les étiquettes fluorescentes et un détecteur enregistre la couleur qui passe à chaque instant.
- Analyse du chromatogramme
L’instrument produit un chromatogramme, une série de pics colorés représentant la séquence de nucléotides. La séquence est lue à partir du chromatogramme, généralement du fragment le plus court au plus long, donnant la séquence complète d’ADN.
Flux de travail pratique de séquençage Sanger
Préparez l’ADN matrice en purifiant le produit PCR ou le plasmide à l’aide d’un kit de nettoyage de colonne. Pour le séquençage du plasmide, utilisez 200 à 500 ng de plasmide purifié ; pour les produits PCR, utilisez 1 à 10 ng pour 100 pb d’amplicon. Configurez la réaction de séquençage du cycle dans un volume de 10 µL : 2 µL de BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Mix, 2 µL de tampon de séquençage 5×, 1 µL d’amorce (3,2 pmol/µL), matrice d’ADN et eau à 10 µL. Utilisez le programme de cycles thermiques suivant : 96°C pendant 1 minute, puis 25 cycles de 96°C pendant 10 secondes, 50°C pendant 5 secondes et 60°C pendant 4 minutes. Purifiez les produits d’extension par précipitation à l’éthanol ou par nettoyage par billes magnétiques pour éliminer les terminateurs de colorant non incorporés. Chargez l’échantillon purifié sur un instrument d’électrophorèse capillaire (par exemple, Applied Biosystems 3730). L’analyse sépare les fragments selon leur taille et un laser excite les colorants fluorescents lorsque les fragments franchissent la fenêtre de détection. Examinez le chromatogramme résultant à l’aide d’un logiciel tel que FinchTV, SnapGene ou Chromas. Les données de bonne qualité s’étendent généralement de 600 à 900 bases à partir de l’amorce. Recherchez des pics nets et régulièrement espacés avec une résolution de base. Les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) apparaissent sous la forme de deux pics superposés à la même position. Une mauvaise qualité au début (20 à 40 premières bases) et à la fin (après 800 bases) est normale : coupez ces régions avant l’analyse. Résolvez les échecs de réaction en augmentant le modèle, en reconcevant les amorces avec une Tm de 60 à 65 °C ou en ajoutant du DMSO (2 à 5 %) pour les modèles riches en GC.
Application du monde réel
Pour confirmer un gène édité par CRISPR dans des embryons de souris, la région cible est amplifiée par PCR et séquencée par Sanger. Le chromatogramme montre des pics mixtes près du site de coupe, indiquant des indels. L’analyse ICE décompose la trace et rapporte une efficacité d’édition de 72 % avec une insertion de 1 pb comme allèle le plus courant. Le séquençage de Sanger reste la référence en matière de validation des modifications du génome en raison de sa précision et de sa rentabilité.
