La PCR par transcription inverse (RT-PCR) est une technique utilisée pour détecter et amplifier l’ARN. Elle combine deux étapes : la transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire (ADNc), suivie d’une amplification PCR de l’ADNc. Cela permet aux scientifiques d’étudier l’expression des gènes et de détecter les virus à ARN.
Comment fonctionne la RT-PCR
- Extraction d’ARN
L’ARN total est extrait de l’échantillon et traité avec de la DNase pour éliminer tout ADN génomique contaminant. La qualité et la concentration de l’ARN sont vérifiées avant de continuer.
- Transcription inversée
L’ARN est mélangé avec une enzyme transcriptase inverse, des amorces aléatoires ou des amorces oligo-dT et des nucléotides. La transcriptase inverse utilise l’ARN comme matrice pour synthétiser un brin d’ADN complémentaire. La matrice d’ARN est ensuite dégradée par la RNase H, laissant un ADNc simple brin.
- Amplification PCR
L’ADNc est ensuite utilisé comme matrice pour une PCR standard avec des amorces spécifiques d’un gène. La PCR amplifie l’ADNc, produisant suffisamment d’ADN pour être visualisé sur un gel ou quantifié par qPCR.
- Détection
Les produits de PCR amplifiés sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. La présence d’une bande à la taille attendue confirme que l’ARN cible était présent dans l’échantillon d’origine.
- Candidatures La RT-PCR est largement utilisée pour mesurer les niveaux d’expression des gènes, détecter les virus à ARN tels que le VIH et le SRAS-CoV-2, valider les données de séquençage de l’ARN et analyser l’épissage alternatif. Lorsqu’il est combiné avec la qPCR, il devient RT-qPCR, permettant une quantification en temps réel de l’ARN.
Protocole RT-PCR pratique
Commencez par extraire l’ARN total à l’aide d’une méthode sur colonne de silice ou à base de TRIzol. Évaluez l’intégrité de l’ARN par électrophorèse sur gel d’agarose ou par un bioanalyseur : l’ARN intact présente des bandes ribosomales 28S et 18S nettes avec un rapport 28S : 18S proche de 2 : 1. Mesurer la concentration et la pureté par spectrophotométrie UV (A260/A280 > 1,8, A260/A230 > 2,0). Traitez 1 à 5 µg d’ARN avec la DNase I à 37°C pendant 30 minutes, puis inactivez par la chaleur à 75°C pendant 10 minutes. Pour la transcription inverse, mélangez l’ARN traité à la DNase avec des hexamères aléatoires ou des amorces oligo-dT (50 à 250 ng), des dNTP 1 mM et 200 U de transcriptase inverse dans le tampon fourni. Incuber à 25°C pendant 10 minutes, 42°C pendant 50 minutes et 70°C pendant 15 minutes. Diluer l’ADNc obtenu 5 à 10 fois avant l’amplification PCR. Incluez toujours un contrôle sans transcriptase inverse (no-RT) pour détecter la contamination par l’ADN génomique — si l’échantillon sans RT produit un produit PCR, de l’ADN résiduel est présent. Pour les amorces spécifiques d’un gène, concevez-les de manière à couvrir une jonction exon-exon afin d’éviter d’amplifier l’ADN génomique ; une amorce directe sur un exon et une amorce inverse sur un exon en aval garantissent que seul l’ADNc épissé est amplifié.
Application du monde réel
Dans le diagnostic du SRAS-CoV-2, la RT-PCR cible les gènes viraux N, E et RdRp à l’aide d’ensembles d’amorces-sondes du CDC ou de l’OMS. L’ARN est extrait des écouvillons nasopharyngés et la RT-qPCR avec des sondes doublement marquées détecte l’ARN viral à des seuils de cycle (Ct) inférieurs à 40. Un résultat positif dans deux des trois gènes cibles confirme l’infection. L’inclusion d’un contrôle interne (par exemple, la RNase P humaine) vérifie l’adéquation de l’échantillon et le succès de l’extraction, évitant ainsi les faux négatifs dus à une mauvaise collecte d’échantillons.
