La chromatographie par exclusion stérique (SEC), également connue sous le nom de chromatographie par perméation de gel (GPC) pour les polymères organiques ou de chromatographie par filtration sur gel (GFC) pour les systèmes aqueux, sépare les molécules en fonction de leur volume hydrodynamique plutôt que de l’interaction chimique avec la phase stationnaire. Un échantillon introduit dans la colonne est transporté par la phase mobile à travers un lit de billes poreuses. Les molécules plus grandes que les plus grands pores (au-dessus de la limite d’exclusion) sont incapables de pénétrer dans les pores et s’éluent en premier. Les molécules suffisamment petites pour pénétrer l’ensemble du réseau de pores (en dessous de la limite de perméation) s’éluent en dernier. Entre ces limites, les molécules s’éluent par ordre de taille décroissante.
La phase stationnaire est constituée de billes de polymère réticulé avec des distributions de taille de pores contrôlées. Les matériaux courants comprennent le polystyrène-divinylbenzène pour la SEC organique, le dextrane (Sephadex), l’agarose (Sepharose) et le polyacrylamide pour la SEC aqueuse. La taille des pores est sélectionnée en fonction de la gamme de poids moléculaire de l’analyte ; des colonnes avec différentes tailles de pores peuvent être connectées en série pour étendre la gamme de séparation. La taille des particules influence à la fois la résolution et la contre-pression, les particules plus petites (3-5 µm) offrant une efficacité plus élevée.
L’étalonnage du poids moléculaire est effectué à l’aide d’étalons polymères à distribution étroite de poids moléculaire connu, généralement du polystyrène, du poly(méthacrylate de méthyle) ou du poly(éthylène glycol), selon le type d’échantillon. La courbe d’étalonnage trace log(Mw) en fonction du volume d’élution. À partir du chromatogramme, les poids moléculaires moyens sont calculés : moyenne en nombre (Mn), moyenne en poids (Mw) et poids moléculaire au pic (Mp). L’indice de polydispersité (PDI = Mw/Mn) indique la largeur de la distribution des poids moléculaires, avec PDI = 1 pour les échantillons monodisperses.
Les applications de la SEC sont centrées sur la caractérisation des polymères, y compris la détermination de la distribution des poids moléculaires, le suivi de la cinétique de polymérisation et l’analyse de la composition des copolymères. La SEC est également employée en biochimie pour la purification des protéines et le dessalage (échange de tampon), dans l’industrie alimentaire pour l’analyse des polysaccharides et des protéines, et dans l’analyse pétrochimique pour la caractérisation des fractions lourdes. La SEC aqueuse (GFC) est largement utilisée pour l’analyse des polymères hydrosolubles, des protéines et des acides nucléiques dans des conditions non dénaturantes.
Les limites de la SEC doivent être prises en compte lors du développement de la méthode. Les effets non liés à l’exclusion stérique tels que les interactions électrostatiques (exclusion ou inclusion ionique sur les phases stationnaires chargées) et l’adsorption hydrophobe peuvent fausser les profils d’élution. La concentration de l’échantillon doit être maintenue faible (généralement < 2 mg/mL) pour éviter les effets de digitation visqueuse et de surcharge. Le choix de la colonne est essentiel : la taille des pores doit correspondre à la gamme de poids moléculaire de l’échantillon, et les débits doivent être maintenus modérés (0,5-1,0 mL/min) pour minimiser la dégradation par cisaillement des polymères de haut poids moléculaire.
