Aperçu
La protéomique ciblée se concentre sur la quantification d’un ensemble prédéfini de protéines avec une sensibilité, une spécificité et un débit élevés, contrairement à la protéomique de découverte qui vise une couverture large et non ciblée. La technique la plus largement adoptée est la surveillance des réactions sélectionnées (SRM, également appelée surveillance des réactions multiples ou MRM) réalisée sur des spectromètres de masse triple quadripôle. Les tests SRM ciblent des transitions peptide-précurseur-fragment spécifiques, connues sous le nom de peptides protéotypiques, qui représentent de manière unique la protéine d’intérêt. Cette approche offre une précision quantitative comparable aux tests immunologiques tout en offrant une capacité de multiplexage plus élevée et un développement de tests plus rapide.
Méthodes
Le développement du test commence par la sélection de peptides protéotypiques : des peptides uniques à la protéine cible, qui volent bien dans le spectromètre de masse et produisent d’intenses fragments d’ions. Pour chaque peptide, plusieurs transitions (ion précurseur m/z vers ion fragment m/z) sont surveillées tout au long de la période d’élution chromatographique. Les étalons internes, généralement des versions marquées par des isotopes stables des peptides cibles, sont ajoutés à l’échantillon à des concentrations connues pour permettre une quantification absolue. La surveillance des réactions parallèles (PRM) sur les instruments Orbitrap offre une approche connexe avec une acquisition à spectre complet haute résolution. Les méthodes d’acquisition indépendante des données (DIA) telles que SWATH-MS comblent le fossé entre la découverte et l’analyse ciblée en enregistrant de manière systématique tous les ions fragments de tous les précurseurs.
Protocole pratique
Le développement d’un test SRM/MRM commence par l’identification de peptides protéotypiques pour la protéine cible. À l’aide des bibliothèques spectrales de PeptideAtlas ou SRMAtlas, le chercheur sélectionne des peptides longs de 7 à 25 acides aminés, dépourvus de sites de clivage manqués, évitant la méthionine et le tryptophane (qui sont sujets à l’oxydation) et produisant des fragments intenses d’ions y ou b à partir de données de spectrométrie de masse. Pour chaque peptide, 3 à 5 transitions sont sélectionnées - les 3 à 5 ions fragments les plus intenses du spectre de la bibliothèque. Un peptide standard marqué par un isotope lourd est synthétisé pour chaque cible, incorporant de l’arginine ou de la lysine marquée au 13C/15N pour produire un déplacement de masse de 6 à 10 Da. L’étalon lourd est ajouté à chaque échantillon à une concentration connue avant ou après la digestion, en fonction de la stratégie de quantification. Le spectromètre de masse triple quadripôle est configuré avec Q1 et Q3 transmettant respectivement les valeurs m/z du précurseur et du fragment, tandis que Q2 effectue une fragmentation induite par collision à des énergies de collision optimisées spécifiques à chaque transition. Le SRM programmé surveille chaque transition dans un délai de rétention de 2 à 3 minutes, maximisant ainsi le nombre de peptides quantifiés par analyse. Les données brutes sont traitées dans Skyline : les pics chromatographiques sont intégrés, les temps de rétention sont confirmés par rapport à l’étalon interne lourd et le rapport entre la surface des pics légers et lourds est calculé. La concentration absolue est dérivée de ce rapport et de la concentration standard connue. Un exemple concret : un test MRM multiplexé quantifiant 50 protéines plasmatiques associées au cancer a été développé pour la détection précoce du cancer du poumon non à petites cellules, atteignant des limites de détection inférieures à 1 ng/mL pour 35 des 50 cibles. Le test a été validé sur 500 échantillons de patients avec des coefficients de variation inférieurs à 15 %.
### Candidatures
La protéomique ciblée est la méthode de choix pour vérifier et valider les biomarqueurs candidats découverts dans des études non ciblées. Il est largement utilisé en recherche clinique pour quantifier des panels de protéines liés à des maladies spécifiques. Les tests complètent les mesures traditionnelles ELISA, offrent une alternative aux approches basées sur gel et à l’électrophorèse capillaire sur gel, et peuvent être multiplexés pour suivre des dizaines de protéines en une seule analyse. L’intégration avec la séparation HPLC et la détection spectrométrie de masse garantit une quantification robuste, tandis que les tests de quantification des protéines fournissent une validation orthogonale de la concentration totale en protéines.
