La PCR sur colonies est une technique de dépistage rapide utilisée pour déterminer si les colonies bactériennes contiennent un plasmide avec le bon insert d’ADN. Au lieu de purifier d’abord l’ADN plasmidique de chaque colonie, la PCR est réalisée directement sur une petite quantité de cellules bactériennes.
Comment fonctionne la PCR sur colonies
- Sélection des colonies
Les colonies bactériennes individuelles poussant sur une plaque de gélose sont prélevées à l’aide d’un embout de pipette stérile ou d’un cure-dent. Chaque colonie est touchée brièvement, transférant une infime quantité de cellules. La même pointe est utilisée pour inoculer à la fois le tube PCR et une plaque mère pour une culture ultérieure.
- Lyse cellulaire
Les cellules bactériennes sont chauffées à 95°C pendant plusieurs minutes lors de l’étape initiale de dénaturation de la PCR. Ce traitement thermique lyse les cellules, libérant l’ADN plasmidique dans le mélange réactionnel. L’ADN libéré sert alors de matrice pour l’amplification.
- Amplification PCR
Des amorces qui flanquent la région d’insertion dans le plasmide sont utilisées. Si la colonie contient un plasmide avec le bon insert, la PCR produira une bande à la taille attendue. Si le plasmide est vide (pas d’insert), la bande sera plus petite. Si la colonie ne contient pas du tout le plasmide, aucune bande ne sera produite.
- Analyse des gels
Les produits de PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Les colonies qui produisent une bande à la taille d’insert attendue sont identifiées comme positives. Ces colonies peuvent ensuite être cultivées pour une purification plasmidique et une analyse plus approfondie.
- Avantages
La PCR sur colonies est rapide et peu coûteuse, permettant de cribler des dizaines de colonies en quelques heures. Il élimine le besoin de purification du plasmide avant le criblage et constitue une première étape standard dans les flux de travail de clonage moléculaire.
Protocole pratique de PCR sur colonie
Choisissez des colonies bactériennes individuelles dans une plaque de gélose sélective à l’aide d’un embout de pipette stérile de 10 µL. Touchez légèrement une seule colonie – évitez de transférer un gros amas de cellules. Étalez la pointe sur une plaque maîtresse fraîche (gélose LB quadrillée avec antibiotique) pour préserver le clone, puis plongez et faites tourbillonner la même pointe dans un tube PCR contenant 20 à 25 µL de mélange maître. Pour chaque colonie, préparez le mélange : 12,5 µL de mélange maître 2× PCR, 0,5 µL chacune d’amorces directes et inverses (10 µM), 1 µL de matrice (la colonie) et de l’eau jusqu’à 25 µL. Utilisez des amorces spécifiques au vecteur flanquant l’insert (par exemple, M13 avant/arrière ou T7/SP6) ou des amorces internes spécifiques à l’insert. Exécutez la PCR avec une dénaturation initiale prolongée à 95 °C pendant 5 à 10 minutes pour garantir une lyse bactérienne complète et une libération d’ADN. Suivez ensuite 30 à 35 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 1 min par ko d’insert attendu, avec une extension finale à 72 °C pendant 5 minutes. Analyser 5 à 10 µL de chaque réaction par électrophorèse sur gel d’agarose. Une bande à la taille d’insert attendue indique un clone positif. Si aucune bande n’apparaît, la colonie peut manquer du plasmide, contenir un vecteur vide (produisant une bande plus petite) ou la lyse a été insuffisante – ce qui réduit la quantité de cellules bactériennes transférées. Pour les bactéries Gram-positives tenaces, ajoutez 0,5 µL de lysozyme (50 mg/mL) au mélange PCR ou effectuez une lyse gel-dégel avant la PCR.
Application du monde réel
Lors du clonage d’une cassette d’expression GFP de 1,2 kb dans pET-28a, les transformants sont étalés sur de la gélose à la kanamycine. Sur 24 colonies criblées par PCR sur colonies avec des amorces de promoteur et de terminateur T7, 18 présentent une bande de 1,2 kb, 4 présentent la bande de vecteur vide (300 pb) et 2 ne produisent aucune bande. Les 18 clones positifs sont utilisés pour la purification et le séquençage des plasmides, confirmant le succès du clonage en moins de 4 heures.
