Le séquençage de l’ARN (RNA-Seq) est une technique qui utilise le séquençage de nouvelle génération pour analyser l’ensemble complet des transcrits d’ARN dans un échantillon de cellule ou de tissu. Il fournit un aperçu de l’expression des gènes, révélant quels gènes sont actifs et à quels niveaux.
Comment fonctionne RNA-Seq
- Extraction d’ARN
L’ARN total est extrait de l’échantillon en utilisant des méthodes similaires à l’isolement de l’ADN, mais avec des étapes supplémentaires pour préserver les molécules d’ARN fragiles. L’intégrité de l’ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel ou par un bioanalyseur.
- Enrichissement en ARNm ou déplétion en ARNr
Étant donné que l’ARN ribosomal constitue la majeure partie de l’ARN total, il est éliminé pour être enrichi en ARN messager (ARNm). Cela se fait à l’aide de billes poly-T qui capturent les queues poly-A de l’ARNm, ou en appauvrissant sélectivement les séquences d’ARN ribosomal.
- Préparation de la bibliothèque
L’ARNm enrichi est fragmenté en petits morceaux et soumis à une transcription inverse en ADN complémentaire (ADNc) à l’aide d’amorces aléatoires. Les adaptateurs sont ligaturés aux fragments d’ADNc et la bibliothèque est amplifiée par PCR.
- Séquençage
La bibliothèque d’ADNc est séquencée sur une plateforme NGS, générant des millions de lectures courtes. Chaque lecture représente une courte séquence d’une extrémité d’un fragment d’ADNc.
- Analyse des données
Les lectures sont alignées sur un génome ou un transcriptome de référence. Le nombre de lectures mappées sur chaque gène est compté pour quantifier les niveaux d’expression. L’analyse de l’expression différentielle identifie les gènes qui sont considérablement régulés à la hausse ou à la baisse entre les conditions.
- Candidatures
RNA-Seq est utilisé pour étudier les changements d’expression génique dans le développement, la maladie, le traitement médicamenteux et les réponses environnementales. Il peut également détecter un épissage alternatif, de nouveaux transcrits et des ARN non codants.
Protocole pratique RNA-Seq
Extrayez l’ARN total à l’aide de TRIzol ou d’une méthode basée sur une colonne avec traitement à la DNase sur colonne. Évaluez l’intégrité de l’ARN sur un bioanalyseur ou une TapeStation : un indice d’intégrité de l’ARN (RIN) > 7 est requis pour l’ARNm-Seq, tandis qu’un > 5 peut suffire pour l’ARN-Seq total avec déplétion en ARNr. Pour l’enrichissement de l’ARNm, incubez 0,1 à 1 µg d’ARN total avec des billes magnétiques poly-T oligo-attachées pour capturer l’ARNm poly-adénylé. Vous pouvez également utiliser un kit Ribo-Zero pour épuiser l’ARNr cytoplasmique et mitochondrial. Fragmentez l’ARNm enrichi par incubation à 94°C pendant 8 minutes dans un tampon de fragmentation, générant des fragments d’environ 200 nt. Synthétiser l’ADNc du premier brin à l’aide d’hexamères aléatoires et de transcriptase inverse à 25°C pendant 10 minutes, 42°C pendant 50 minutes et 70°C pendant 15 minutes. Remplacez le brin d’ARN par dUTP lors de la synthèse du deuxième brin pour permettre la spécificité du brin - le deuxième brin contenant du dUTP sera sélectivement dégradé lors de l’amplification de la bibliothèque. Effectuez la réparation des extrémités, l’a-tailing et la ligature de l’adaptateur comme dans la préparation de bibliothèque NGS standard. Dégrader le deuxième brin marqué au dUTP à l’aide de l’enzyme USER avant l’enrichissement par PCR (10 à 15 cycles). Séquencez la bibliothèque finale sur une plate-forme Illumina générant 20 à 40 millions de lectures appariées par échantillon (2 × 75 pb ou 2 × 150 pb). Traitez les fichiers FASTQ bruts via un pipeline bioinformatique : coupez la qualité avec cutadapt, alignez-vous sur le génome de référence à l’aide de STAR (mode 2 passes pour les nouvelles jonctions d’épissage), quantifiez le nombre de gènes au niveau des gènes avec featureCounts ou HTSeq et identifiez les gènes différentiellement exprimés avec DESeq2 ou edgeR en utilisant un faux seuil de taux de découverte de 0,05. Incluez au moins trois répétitions biologiques par condition pour la puissance statistique.
Application du monde réel
Dans une étude comparant les hépatocytes traités avec le médicament et les hépatocytes témoins, RNA-Seq identifie 1 247 gènes différentiellement exprimés (FDR < 0,05). L’analyse de l’enrichissement des voies révèle une régulation positive des gènes du métabolisme lipidique et une régulation négative des voies inflammatoires. Les données sont validées par RT-qPCR sur 10 gènes sélectionnés, confirmant la direction et l’ampleur des changements de repli.
